構(gòu)建背景：TPO 是調(diào)控巨核細(xì)胞增殖分化與血小板生成的關(guān)鍵細(xì)胞因子，該細(xì)胞系通過載體介導(dǎo)（如含 CMV 啟動子的表達(dá)質(zhì)粒）將人 TPO 基因?qū)?CHO 細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定分泌株，“I" 代表篩選得到的高表達(dá)克隆，確保 TPO 產(chǎn)量的均一性。

形態(tài)與增殖：體外培養(yǎng)時呈典型上皮樣形態(tài)，貼壁生長，細(xì)胞呈多邊形，排列緊密，形態(tài)與親本 CHO 細(xì)胞一致。在 37℃、5% CO?條件下，傳代周期約 2-3 天，可適應(yīng)含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，兼容懸浮培養(yǎng)與無血清體系，高密度培養(yǎng)時（細(xì)胞密度達(dá) 1×10?個 /mL）仍能保持穩(wěn)定增殖，為大規(guī)模生產(chǎn) TPO 奠定基礎(chǔ)。

表達(dá)特征：TPO 主要分泌至細(xì)胞外培養(yǎng)基中，表達(dá)量可達(dá) 5-10μg/（10?細(xì)胞?24h），且長期傳代（＞30 代）后分泌量波動＜15%。分泌的 TPO 為糖基化蛋白，分子量約 70kDa（含糖鏈），與天然人 TPO 的結(jié)構(gòu)與活性高度一致，通過 Western blot 可檢測到特異性條帶，且能被 TPO 抗體中和。

優(yōu)勢：TPO 分泌穩(wěn)定，避免重組蛋白表達(dá)的批次差異；產(chǎn)物活性高，糖基化修飾與天然 TPO 一致，生物活性（如刺激巨核細(xì)胞增殖）是原核表達(dá) TPO 的 3-5 倍；培養(yǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，可通過懸浮培養(yǎng)放大生產(chǎn)，降低大規(guī)模制備成本；分泌型表達(dá)便于產(chǎn)物純化，無需裂解細(xì)胞，簡化下游處理流程。

局限性：長期培養(yǎng)需維持抗生素篩選壓力（如 2μg/mL 嘌呤霉素），否則易丟失表達(dá)質(zhì)粒；TPO 分泌可能受細(xì)胞密度影響，需優(yōu)化培養(yǎng)條件以保持產(chǎn)量穩(wěn)定；作為異源表達(dá)系統(tǒng)，其糖基化模式與人類細(xì)胞存在細(xì)微差異，雖不影響主要活性，但用于臨床級藥物生產(chǎn)時需進(jìn)一步驗(yàn)證。

培養(yǎng)條件：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含 10% 胎牛血清、2μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM/F12，添加青mei素 - 鏈mei素防污染。傳代時用 0.25% yi酶消化，貼壁培養(yǎng)融合度控制在 60%-80%，避免過度密集導(dǎo)致 TPO 分泌量下降。懸浮培養(yǎng)可采用含 5% 血清的 CDM4CHO 培養(yǎng)基，通過生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，TPO 產(chǎn)量可達(dá) 20-50mg/L。

TPO 活性檢測：推薦使用巨核細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證活性，如將培養(yǎng)上清與 UT-7/TPO 細(xì)胞共孵育 48 小時，通過 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，活性單位定義為刺激 50% 最大增殖的上清稀釋倍數(shù)，通常比活性＞1×10?U/mg。

凍存與復(fù)蘇：凍存液含 10% DMSO、2μg/mL 嘌呤霉素，液氮保存可維持活性 3 年以上；復(fù)蘇時 37℃快速解凍，離心后用含篩選壓力的培養(yǎng)基重懸，傳代 2 次后檢測 TPO 分泌量，確保活性穩(wěn)定。