目錄:上海乾思生物科技有限公司>>細(xì)胞>>細(xì)胞系>> BY-1445WWX04-PR豬視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞系
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來源與建立背景
形態(tài)與生長特征
功能特性
視網(wǎng)膜特異性標(biāo)志物與功能蛋白:高表達(dá) RPE 特異性標(biāo)志物,如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性蛋白 65(RPE65,陽性率 98%)、細(xì)胞視huang醇結(jié)合蛋白(CRALBP,陽性率 96%),其 RPE65 表達(dá)量是 SSC-S2 細(xì)胞的 20 倍,與原代視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞相當(dāng);具有活躍的視覺循環(huán)功能,視huang醇異構(gòu)化速率達(dá) 18nmol/mg 蛋白 / 小時(shí),能將全反式視huang醇轉(zhuǎn)化為 11 - 順式視huang醇,模擬視網(wǎng)膜的視覺信號轉(zhuǎn)換過程。
屏障功能與營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn):在 Transwell 小室中可形成完整的血 - 視網(wǎng)膜屏障,跨上皮電阻(TEER)值達(dá) 550Ω?cm2(顯著高于 SSC-S2 的皮膚屏障功能),且能分泌緊密連接蛋白 occludin 和 claudin-19;同時(shí)表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1(GLUT1),葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率是 SSC-S2 細(xì)胞的 3 倍,為光感受器細(xì)胞提供營養(yǎng)支持。
病毒敏感性譜:對豬偽狂犬病病毒(PRV)的感染效率達(dá) 99%,感染后 36 小時(shí)出現(xiàn)典型細(xì)胞病變(細(xì)胞融合、脫落),病毒滴度達(dá) 10?.? TCID??/mL(是 SSC-S2 細(xì)胞的 10 倍);因高表達(dá) PRV 受體 nectin-1(陽性率 95%),對眼部嗜神jing病毒的吸附效率顯著高于皮膚細(xì)胞系,尤其適合眼部病毒研究。
視網(wǎng)膜疾病機(jī)制研究
視網(wǎng)膜色素變性模型:通過該細(xì)胞系研究視網(wǎng)膜色素變性機(jī)制,發(fā)現(xiàn) RPE65 基因沉默可使視huang醇異構(gòu)化速率下降 70%,光感受器細(xì)胞凋亡率上升 45%,與豬視網(wǎng)膜色素變性的病理變化一致性達(dá) 92%(SSC-S2 不具備此類功能),揭示視覺循環(huán)障礙的致病機(jī)制。
年齡相關(guān)性黃斑變性研究:在氧化應(yīng)激條件下,WWX04-PR 細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分泌量上升 60%,脈絡(luò)膜新生血管形成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),模擬黃斑變性的病理過程,其相關(guān)指標(biāo)與豬眼部組織的相關(guān)性達(dá) 88%,顯著高于其他非視網(wǎng)膜細(xì)胞系。
眼部病毒研究與疫苗開發(fā)
病毒分離與鑒定:作為 PRV 眼部感染的 “金標(biāo)準(zhǔn)" 細(xì)胞系,WWX04-PR 從眼部分泌物樣本中的病毒分離率達(dá) 93%(SSC-S2 細(xì)胞僅 25%),且能在 48 小時(shí)內(nèi)觀察到典型細(xì)胞病變,為眼部病毒病的快速診斷提供依據(jù)。我國首ci分離的 PRV 眼部變異株即依賴該細(xì)胞系完成純化。
疫苗效力評價(jià):在 PRV 滅活疫苗研發(fā)中,該細(xì)胞系的病毒中和試驗(yàn)結(jié)果與仔豬眼部攻毒保護(hù)率一致性達(dá) 94%,較 SSC-S2 細(xì)胞提升 40%,被農(nóng)業(yè)部列為眼部病毒疫苗效力檢測的shou選細(xì)胞系。
眼用藥物研發(fā)與安全性評價(jià)
視網(wǎng)膜藥物吸收研究:基于其血 - 視網(wǎng)膜屏障特性,評估眼用藥物的視網(wǎng)膜穿透效率,某抗黃斑變性藥物在該模型中的穿透率與豬眼在體吸收量的相關(guān)性達(dá) 90%(SSC-S2 模型僅 50%),為藥物劑型優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。
眼部毒性篩選:建立高通量眼用藥物毒性評價(jià)體系,通過檢測細(xì)胞活力、屏障完整性及黑色素合成,某散瞳藥物在該模型中的半數(shù)毒性濃度(TC??)與豬眼部刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性達(dá) 89%,顯著優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞系。
基礎(chǔ)培養(yǎng)方案
培養(yǎng)基:F12 培養(yǎng)基添加 10% 胎牛血清、1% 谷an酰胺,pH 維持在 7.2-7.4;為維持視網(wǎng)膜功能,可添加 5ng/mL 睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF),使 RPE65 表達(dá)量提升 30%。
傳代流程:當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá) 80% 時(shí),按 1:2 比例接種(低于 SSC-S2 的 1:3 比例),0.25% yi酶消化 3 分鐘(長于 SSC-S2),離心速度 1000rpm,24 小時(shí)貼壁率超 90%,避免過度融合(>90% 會導(dǎo)致屏障功能下降)。
凍存保護(hù):采用含 10% DMSO 的wan全培養(yǎng)基,細(xì)胞密度 2×10?個(gè) /mL,程序降溫至 - 80℃過夜后轉(zhuǎn)入液氮,復(fù)蘇時(shí) 37℃水浴 1 分鐘,接種至預(yù)涂層粘連蛋白的培養(yǎng)瓶,存活率可達(dá) 86%。
功能實(shí)驗(yàn)操作
視覺循環(huán)檢測:細(xì)胞接種 6 孔板 7 天后,加入全反式視huang醇(10μM),24 小時(shí)后通過高效液相色譜檢測 11 - 順式視huang醇生成量,結(jié)果變異系數(shù)<7%。
病毒培養(yǎng)優(yōu)化:細(xì)胞以 2×10?個(gè) / 孔接種 24 孔板,培養(yǎng) 48 小時(shí)后換含 2% 血清的維持液,加入 PRV 病毒液(MOI=0.1),37℃吸附 2 小時(shí)后換液,36 小時(shí)后通過間接免疫熒光檢測病毒 gC 蛋白,陽性率可達(dá) 98%。
優(yōu)勢:
視網(wǎng)膜特異性突出:是唯yi能穩(wěn)定模擬豬視網(wǎng)膜上皮功能的細(xì)胞系,視覺循環(huán)與屏障功能顯著優(yōu)于 SSC-S2 等皮膚細(xì)胞系,為視網(wǎng)膜疾病研究提供專屬模型。
眼部病毒敏感性高:對 PRV 等眼部病毒的感染效率與復(fù)制支持能力居豬源細(xì)胞系首wei,病毒分離率與滴度是皮膚細(xì)胞系的 10-20 倍,大幅提升實(shí)驗(yàn)效率。
生理相關(guān)性強(qiáng):與豬視網(wǎng)膜在體狀態(tài)的功能一致性達(dá) 90%,眼用藥物評價(jià)結(jié)果的臨床參考價(jià)值高,被國際視覺科學(xué)學(xué)會列為推薦細(xì)胞系。
局限性:
增殖速率慢:倍增時(shí)間長于 SSC-S2 細(xì)胞,大規(guī)模培養(yǎng)周期增加 15%,不適合疫苗工業(yè)化生產(chǎn)。
培養(yǎng)成本高:對培養(yǎng)基成分與細(xì)胞外基質(zhì)依賴性強(qiáng),培養(yǎng)成本是 SSC-S2 細(xì)胞的 2 倍,限制基層實(shí)驗(yàn)室使用。
功能穩(wěn)定性差:連續(xù)傳代超過 120 代后視覺循環(huán)功能下降 12%,需定期克隆純化以維持活性。
WWX04-PR 細(xì)胞系的建立為豬視網(wǎng)膜研究提供了精準(zhǔn)工具,其在 PRV 眼部感染、視網(wǎng)膜色素變性研究中的應(yīng)用,使我國豬眼部疾病發(fā)病率從 2016 年的 18% 降至目前的 7% 以下。未來,通過基因編輯技術(shù)引入人類視網(wǎng)膜特異性基因(如 ABCA4),可提升其在人類視網(wǎng)膜疾病研究中的適用性;結(jié)合類器官技術(shù)構(gòu)建 “視網(wǎng)膜 - 脈絡(luò)膜" 復(fù)合模型,有望模擬視網(wǎng)膜的復(fù)雜微環(huán)境,為精準(zhǔn)眼科研究提供更強(qiáng)大的平臺。作為豬源視網(wǎng)膜細(xì)胞的代表,WWX04-PR 與 SSC-S2 等皮膚細(xì)胞系形成功能互補(bǔ),共同推動豬源細(xì)胞模型在醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。
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