來源與構(gòu)建：該細(xì)胞系以 CHO-K1 為親本，通過設(shè)計(jì)靶向 Dnmt3b 基因第 7 外顯子的 sgRNA，經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因編輯，篩選獲得 Dnmt3b 表達(dá)下調(diào) 70%-80% 的單克隆株（“Dnmt3b-7" 標(biāo)識(shí)靶向位點(diǎn)與克隆編號(hào)）。構(gòu)建過程中未引入外源抗性基因，通過 T7EI 酶切與測(cè)序驗(yàn)證，確保編輯效率＞90%，且無脫靶效應(yīng)（全基因組測(cè)序顯示脫靶率＜0.01%）。

形態(tài)與增殖：體外培養(yǎng)呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞鋪展面積略大于野生型 CHO，排列較疏松；懸浮培養(yǎng)形成直徑 25-50μm 的聚集體，均一度良好（變異系數(shù)＜18%）。37℃、5% CO?條件下，增殖周期約 32-38 小時(shí)，較野生型延長(zhǎng) 4-6 小時(shí)，適應(yīng)含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基，傳代 80 次以上 Dnmt3b 表達(dá)量穩(wěn)定（下調(diào)幅度波動(dòng)＜5%），凍存復(fù)蘇后存活率超 85%。

功能特征：核心優(yōu)勢(shì)在于 DNA 甲基化譜的特異性改變：全基因組甲基化芯片顯示，其基因組 CG 島甲基化水平平均降低 28%，其中啟動(dòng)子區(qū)低甲基化基因占比達(dá) 15%（顯著高于野生型的 3%），尤以細(xì)胞周期調(diào)控、代謝相關(guān)基因啟動(dòng)子低甲基化最為顯著（如 CDKN2A 啟動(dòng)子甲基化水平下降 42%）。同時(shí)，Dnmt3b 下游靶基因（如 HOX 家族基因）表達(dá)量上調(diào) 2-5 倍（qPCR 驗(yàn)證），wan美模擬 Dnmt3b 功能缺失的表觀遺傳表型。

貼壁培養(yǎng)操作：

甲基化檢測(cè)樣本制備：

凍存流程：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1000rpm 離心 5 分鐘，用凍存液（70% wan全培養(yǎng)基 + 20% 胎牛血清 + 10% DMSO）重懸至 6×10?個(gè) /mL，分裝至凍存管，程序降溫盒 - 80℃過夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮保存，保存期可達(dá) 5 年以上，復(fù)蘇后需傳代 2 次再進(jìn)行甲基化相關(guān)實(shí)驗(yàn)（確保表觀遺傳狀態(tài)穩(wěn)定）。

優(yōu)勢(shì)：Dnmt3b 表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)，甲基化表型重復(fù)性高（批間差異＜6%）；無外源抗性基因干擾，適合長(zhǎng)期表觀遺傳研究；全基因組甲基化譜特征明確，可作為甲基化異常模型的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照；對(duì)甲基化藥物響應(yīng)靈敏，篩選效率較野生型提升 40%。

局限性：部分基因甲基化改變可能非 Dnmt3b 直接調(diào)控（需結(jié)合 ChIP 驗(yàn)證）；長(zhǎng)期傳代（＞80 次）可能出現(xiàn)甲基化補(bǔ)償性恢復(fù)（約 5%-8%）；增殖速率較慢，大規(guī)模實(shí)驗(yàn)需提前規(guī)劃培養(yǎng)周期。