來(lái)源與構(gòu)建：該細(xì)胞系以 CHO-S 為親本，采用 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的定點(diǎn)整合技術(shù)，將含 B9Z4 啟動(dòng)子、目的基因克隆位點(diǎn)及嘌呤霉素抗性基因的表達(dá)盒插入 CHO 基因組的 Rosa26 安全位點(diǎn)。名稱(chēng)中 “247A-B9Z4-02-C-T9" 為克隆篩選標(biāo)識(shí)，其中 “B9Z4" 代表核心調(diào)控元件 —— 一種受蛻皮激素類(lèi)似物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，可通過(guò)添加 ponasterone A 實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)的時(shí)序調(diào)控。構(gòu)建過(guò)程中引入基質(zhì)附著區(qū)（MAR）序列，使外源基因表達(dá)波動(dòng)控制在 4% 以?xún)?nèi)，顯著優(yōu)于隨機(jī)整合株系。

形態(tài)與增殖：體外培養(yǎng)呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)時(shí)呈多角形，排列緊密；懸浮培養(yǎng)形成直徑 15-35μm 的均一聚集體，細(xì)胞圓潤(rùn)透亮，活力長(zhǎng)期維持在 93% 以上。37℃、5% CO?條件下，增殖周期約 28-34 小時(shí)，適應(yīng)多種無(wú)血清化學(xué)限定培養(yǎng)基（如 Gibco CD OptiCHO），傳代 120 次以上生長(zhǎng)速率無(wú)明顯下降，誘導(dǎo)后目標(biāo)蛋白表達(dá)量衰減＜6%，凍存復(fù)蘇后存活率超 90%。

功能特征：該細(xì)胞系的核心優(yōu)勢(shì)在于 B9Z4 啟動(dòng)子的誘導(dǎo)特異性：未誘導(dǎo)時(shí)目標(biāo)蛋白基礎(chǔ)表達(dá)量＜0.05μg/mL（僅為誘導(dǎo)狀態(tài)的 0.5%）；添加 1μM ponasterone A 后，36 小時(shí)內(nèi)表達(dá)量可達(dá) 3-6g/L（流加培養(yǎng)），誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá) 100-200 倍（ELISA 檢測(cè)），且誘導(dǎo)效率在 0.1-10μM 范圍內(nèi)呈嚴(yán)格劑量依賴(lài)性，便于精準(zhǔn)調(diào)控蛋白合成速率，尤其適合毒性蛋白的生產(chǎn)。

貼壁培養(yǎng)操作：

懸浮誘導(dǎo)培養(yǎng)：

凍存流程：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1000rpm 離心 5 分鐘，用凍存液（85% 無(wú)血清培養(yǎng)基 + 10% 胎牛血清 + 5% DMSO）重懸至 6×10?個(gè) /mL，分裝至凍存管，程序降溫盒 - 80℃過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮保存，保存期可達(dá) 6 年以上。

優(yōu)勢(shì)：B9Z4 啟動(dòng)子誘導(dǎo)背景更低（＜0.5% 誘導(dǎo)表達(dá)量），適合高毒性蛋白生產(chǎn)；ponasterone A 誘導(dǎo)劑無(wú)細(xì)胞毒性，可維持長(zhǎng)期高表達(dá)；定點(diǎn)整合結(jié)合 MAR 序列，傳代 80 次表達(dá)穩(wěn)定；產(chǎn)物糖基化均一性?xún)?yōu)異（批間差異＜4%），符合 FDA/EMA 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

局限性：ponasterone A 成本高于四環(huán)素類(lèi)誘導(dǎo)劑（約為 2 倍）；誘導(dǎo)后 24-36 小時(shí)才達(dá)表達(dá)峰值，快速響應(yīng)實(shí)驗(yàn)需提前規(guī)劃；對(duì)培養(yǎng)基中固醇類(lèi)物質(zhì)敏感，需嚴(yán)格控制成分一致性。