來(lái)源與構(gòu)建：該細(xì)胞系以 CHO-S 為親本，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染將含人源 KLs 全長(zhǎng) cDNA 與 C 端 12×his 標(biāo)簽的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，經(jīng) Zeocin 抗性篩選及單克隆純化獲得穩(wěn)定株。KLs 基因由 EF1α 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，結(jié)合分泌信號(hào)肽優(yōu)化序列，確保融合蛋白高效分泌至培養(yǎng)基（分泌效率達(dá) 85% 以上），名稱(chēng)中 “hKLs-his-12" 直接標(biāo)識(shí)其表達(dá)的核心蛋白及標(biāo)簽特征。

形態(tài)與增殖：體外培養(yǎng)呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)時(shí)呈多角形，排列緊密；懸浮培養(yǎng)可形成直徑 20-50μm 的松散聚集體，細(xì)胞圓潤(rùn)透亮，活力長(zhǎng)期維持在 92% 以上。37℃、5% CO?條件下，增殖周期約 28-34 小時(shí)，適應(yīng)無(wú)血清化學(xué)限定培養(yǎng)基（如 Gibco CD CHO），傳代 70 次以上仍保持穩(wěn)定生長(zhǎng)速率，hKLs-his-12 表達(dá)量無(wú)明顯衰減，凍存復(fù)蘇后存活率超 90%。

表達(dá)特征：該細(xì)胞系的核心優(yōu)勢(shì)在于重組蛋白的高表達(dá)與可純化性：懸浮流加培養(yǎng)條件下，hKLs-his-12 蛋白表達(dá)量達(dá) 3-5g/L，經(jīng) Ni2?親和層析純化后純度超 98%（SDS-PAGE 檢測(cè)）；Western blot 顯示其分子量約 68kDa，與理論值一致，且保留 KLs 的天然活性（可抑制成纖維細(xì)胞衰老標(biāo)志物 p16 表達(dá)，抑制率達(dá) 40%-50%）。

貼壁培養(yǎng)操作：

懸浮培養(yǎng)與蛋白純化：

凍存流程：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1000rpm 離心 5 分鐘，用凍存液（90% 無(wú)血清培養(yǎng)基 + 10% DMSO）重懸至 6×10?個(gè) /mL，分裝至凍存管，程序降溫盒 - 80℃過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮保存，保存期可達(dá) 5 年以上。

優(yōu)勢(shì)：hKLs-his-12 蛋白表達(dá)穩(wěn)定，批次間活性差異＜7%；12×his 標(biāo)簽可高效結(jié)合 Ni2?柱，純化步驟簡(jiǎn)單（純度一步可達(dá) 95%）；懸浮培養(yǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，可放大至反應(yīng)器規(guī)模生產(chǎn)；蛋白活性接近天然 KLs，功能實(shí)驗(yàn)可靠性高。

局限性：高濃度重組蛋白（＞10μg/mL）可能抑制細(xì)胞增殖，需定期更換培養(yǎng)基；his 標(biāo)簽可能干擾部分蛋白互作實(shí)驗(yàn)，需結(jié)合標(biāo)簽切除驗(yàn)證；培養(yǎng)成本高于普通 CHO 細(xì)胞（因無(wú)血清培養(yǎng)基價(jià)格較高）。