▍點(diǎn)突變斑馬魚模型構(gòu)建

人類致病基因單核苷酸變異（SNV）的精準(zhǔn)解析是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要基礎(chǔ)。隨著全基因組測(cè)序在臨床診斷中的推廣應(yīng)用，臨床醫(yī)生和科研人員在罕見病、神經(jīng)發(fā)育障礙等疾病中已鑒定出大量SNV，然而根據(jù)ClinVar（地球臨床變異公共數(shù)據(jù)庫）的統(tǒng)計(jì)（截至2024年）超過70%的錯(cuò)義突變因缺乏功能證據(jù)被歸類為“意義未明（VUS）"，亟需通過功能性動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。斑馬魚與人類在單基因遺傳病相關(guān)基因中共享70%-80%的直系同源基因，且關(guān)鍵蛋白功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列同源性可達(dá)85%以上（Howe K, et al., 2013），使其成為模擬人類致病SNV的理想模型。利用堿基編輯技術(shù)模擬特定SNV的精準(zhǔn)斑馬魚模型不僅能闡明基因型-表型關(guān)聯(lián)，還可通過其胚胎和幼魚通量化藥篩系統(tǒng)為個(gè)體化治療方案制定提供臨床前驗(yàn)證平臺(tái)。

堿基編輯技術(shù)通過CRISPR/Cas9衍生物與脫氨酶的融合系統(tǒng)，在不誘發(fā)DNA雙鏈斷裂的前提下實(shí)現(xiàn)C>T或A>G的精準(zhǔn)堿基替換，其單堿基編輯效率可達(dá)50%-80%，為精確復(fù)現(xiàn)人類SNV提供了高效工具。

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▍成功案例 

Axenfeld–Rieger綜合征（ARS）是一種臨床上多樣化的常染色體顯性遺傳疾病，其特征是眼前節(jié)異常，顱面和牙齒不規(guī)則，心血管畸形以及其他導(dǎo)水管周圍皮膚。PITX2中的p.Q50 * 突變與引起ARS有關(guān)。

圖1. 斑馬魚pitx2 Q48* gRNA靶向圖

使用寬松編輯基序限制且高效的堿基編輯器zTad-SpRY-BE4max進(jìn)行靶向編輯后（Zheng S, et al., 2025），成功在斑馬魚中構(gòu)建了精準(zhǔn)模擬人類PITX2 Q50*的pitx2 Q48*模型，pitx2 Q48*純合子F1突變體在5 dpf時(shí)表現(xiàn)出前房發(fā)育不足和顱面畸形，反映了人類ARS病例中的表型特征。

圖2. 斑馬魚pitx2 Q48*純合子突變體F1表型（紅色箭頭指示眼部前房發(fā)育不足，虛線顯示顱骨畸形）

▍參考文獻(xiàn)

1、斑馬魚參考基因組序列及其與人類基因組的關(guān)系

The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome

斑馬魚已成為研究脊椎動(dòng)物基因功能的重要模式生物。它們的胚胎幾乎透明，并且可以通過基因敲低或過表達(dá)來加快遺傳學(xué)研究的進(jìn)程，因此斑馬魚被廣泛用于脊椎動(dòng)物基因功能的深入研究，并逐漸應(yīng)用于人類遺傳疾病的研究。

然而，要有效構(gòu)建人類遺傳疾病的模型，了解斑馬魚基因及其結(jié)構(gòu)與人類同源基因之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系至關(guān)重要。為此，我們構(gòu)建了一個(gè)高質(zhì)量的斑馬魚基因組序列圖譜。該圖譜由一套重疊的、完整測(cè)序的大插入克隆組成，并通過高分辨率、高密度的減數(shù)分裂圖譜進(jìn)行了排序與定位。

通過詳細(xì)的自動(dòng)化和人工注釋，我們鑒定出超過26,000個(gè)蛋白編碼基因，是目前已測(cè)序脊椎動(dòng)物中已知基因數(shù)量最多的物種。與人類參考基因組的比對(duì)結(jié)果顯示，大約70%的人類基因在斑馬魚中都能找到至少一個(gè)明顯的同源基因。

此外，這一高質(zhì)量的基因組組裝還揭示了多個(gè)重要的基因組特征，例如其不同的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)、假基因數(shù)量少、第4號(hào)染色體上斑馬魚單有基因的富集現(xiàn)象，以及與性別決定相關(guān)的染色體區(qū)域。

2、攜帶提前終止密碼子（PTC）的mRNA通過Upf3a和COMPASS復(fù)合物組分引發(fā)遺傳補(bǔ)償反應(yīng)

PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components

遺傳補(bǔ)償反應(yīng)（GCR）近年來被提出，用以解釋基因敲除和基因敲低實(shí)驗(yàn)中觀察到的表型差異。然而，GCR的分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們利用斑馬魚的capn3a和nid1a基因的敲低與敲除模型，發(fā)現(xiàn)攜帶提前終止密碼子（PTC）的mRNA可迅速誘發(fā)一種涉及Upf3a和COMPASS復(fù)合物組分的遺傳補(bǔ)償反應(yīng)。

我們觀察到，capn3a敲低胚胎表現(xiàn)出肝臟發(fā)育不良，nid1a敲低胚胎則表現(xiàn)出體長(zhǎng)縮短，但相應(yīng)的基因敲除突變體卻表現(xiàn)正常。這一差異被歸因于同一家族中其他基因的上調(diào)表達(dá)。

通過設(shè)計(jì)六種轉(zhuǎn)基因模型，我們進(jìn)一步證實(shí)，GCR的激活不僅依賴于PTC的存在，還依賴于轉(zhuǎn)基因mRNA序列，及其與內(nèi)源性補(bǔ)償基因的同源性。研究還發(fā)現(xiàn)，無義介導(dǎo)的mRNA降解通路中的Upf3a，以及COMPASS復(fù)合物中的關(guān)鍵成分如Wdr5，在GCR中發(fā)揮重要作用。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，GCR的發(fā)生伴隨著補(bǔ)償性基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域組蛋白H3第4位賴氨酸三甲基化（H3K4me3）水平的上調(diào)。

這些發(fā)現(xiàn)為GCR提供了可能的分子機(jī)制基礎(chǔ)，并有望為治療與錯(cuò)義突變相關(guān)的遺傳疾病提供新策略——通過在突變基因中引入PTC，或引入含有PTC的轉(zhuǎn)基因，來激活GCR以達(dá)到治療的目的。

3、斑馬魚全基因組編輯中不依賴序列環(huán)境的TadA衍生胞嘧啶堿基編輯器

Sequence Context-Agnostic TadA-Derived Cytosine Base Editors for Genome-Wide Editing in Zebrafish

單核苷酸變異（SNVs）是與多種疾病密切相關(guān)的重要遺傳變異形式。CRISPR介導(dǎo)的堿基編輯技術(shù)已成為研究SNV致病機(jī)制的重要工具，尤其適用于斑馬魚這一理想的疾病模型和藥物篩選平臺(tái)。然而，目前應(yīng)用于斑馬魚的胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）普遍存在編輯窗口寬泛、序列依賴性強(qiáng)等問題，限制了其應(yīng)用效果。

在本研究中，我們通過在TadA8e酶中引入關(guān)鍵突變，開發(fā)出一系列斑馬魚專用的TadA衍生胞嘧啶堿基編輯器，命名為zTadA-CBEs。這些新型編輯器在編輯效率和精度方面均顯著提升。其中，zTadA-BE4max與zTadA-BEmv提供了互補(bǔ)的編輯窗口，而zTadA-SpRY-BE4max則實(shí)現(xiàn)了對(duì)PAM序列更為靈活的編輯能力。

我們借助zTadA-CBEs成功建立了一個(gè)精準(zhǔn)的Axenfeld-Rieger綜合征模型，并構(gòu)建了兩個(gè)Hermansky-Pudlak綜合征的新模型。同時(shí)，還建立了一個(gè)新型白化病模型，其F0代個(gè)體攜帶兩個(gè)致病SNVs。

在功能恢復(fù)實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性sgRNA，將fmsts±錯(cuò)義突變由T糾正為野生型的C，有效恢復(fù)了巨噬細(xì)胞數(shù)量至正常水平。

研究結(jié)果表明，zTadA-CBEs顯著提高了基因組編輯的能力，并為開發(fā)SNV相關(guān)疾病的治療策略提供了有力支持。