磺胺嘧啶檢測試劑盒（養(yǎng)殖水樣）使用說明書

【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺嘧啶與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺的抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含磺胺嘧啶的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出殘留物磺胺嘧啶的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度：0.2ppb

檢測時間： 45min

樣本定量檢測下限：  

水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水………………………………………3ppb

樣本回收率

水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水…………………………………80±15%

反應(yīng)率 ：

磺胺嘧啶 …………………………………… 100%

【試劑盒組成】   

1． 微量測試孔：每條8孔，一板12條

2． 標(biāo) 準(zhǔn) 液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.2ppb、0.6pb、 1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

3． 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb

4． 酶標(biāo)記物     7ml ………………………  紅色帽

5． 抗體工作液 7ml ………………………  綠色帽

6． 底物A液    7ml ………………………  棕色帽

7． 底物B液　7 ml ………………………  黑色帽

8． 終止液        7 ml …..…………………… 黃色帽

9． 20X濃縮洗滌液40 ml …………………白色帽

10． 2X濃縮復(fù)溶液 50 ml …………………  藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

試         劑：去離子水（或蒸餾水）

【實驗前溶液配制】

配液1、1×樣本復(fù)溶液：用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1：1稀釋

（1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本復(fù)溶。

配液2：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

               稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量

               配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

樣本前處理須知    處理任何樣本時，都必須注意：

（1）本試劑盒所檢測的水樣樣本包括：養(yǎng)殖用水和水產(chǎn)尾水。

（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同試劑時要更換吸頭。

（3）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理步驟

（a）水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水

1、取50µl待檢水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水與200µl配制好的1×樣本復(fù)溶液按稀釋，混合30s；

2、取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：5倍      

【酶標(biāo)免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】   

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與磺胺嘧啶的含量成負(fù)相關(guān)。

1、 粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng /ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.221，樣本2的吸光度值為0.795，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.81；0.2ppb為1.50；0.6ppb為1.114；1.8ppb為0.660； 5.4ppb為0.318；16.2ppb為0.145。則樣本1的濃度范圍是5.4ppb-16.2ppb；樣本2的濃度范圍是0.6ppb-1.8ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺嘧啶實際含量。

2、 定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺嘧啶濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺嘧啶實際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

         0.2                0.6                1.8                   5.4               16.2

 (ppb) [µg/kg]

圖1：磺胺嘧啶檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV 

      0      0.2            0.6             1.8          5.4         16.2

(ppb) [µg/kg]

圖2：磺胺嘧啶檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出磺胺嘧啶檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)磺胺嘧啶濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。