關鍵詞:細胞轉染技術服務|實驗技術服務
簡介：世界*品牌細胞轉染技術服務|實驗技術服務原裝，質量保證,*。
細胞轉染技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
一、細胞傳代
1. 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。
2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次
3. 用tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37℃，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞*從壁上脫落下來為止。
4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。
5. 用Tip頭多次吹吸，使細胞*分散開。
6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
7. 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。
8. 將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。
9. 將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉染。
二、細胞轉染
1. 轉染試劑的準備
① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。
② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。
2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。
4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
5. 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
6. 到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。
三、第二次細胞傳代
1. 在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。
2. 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉入培養(yǎng)皿中。
3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。
慢病毒轉染貼壁細胞實驗方法
1、慢病毒轉染前18-24小時，將貼壁細胞以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液。37℃孵育。
3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。
4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。
5、繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉染48小時后可見明顯熒光表達，72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉染效率，可在轉染后72-96小時進行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉染3-4天后開始加藥。
1.  在6孔板中接種1~3×105細胞/孔，加入2ml*培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)。
2.  待細胞長到50-80%單層時，在無菌離心管中配制如下溶液：
i.  溶液A：將4?g待轉染的超純DNA稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5min
ii.  溶液B：將2-25?l LipofectAMINE 稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5min
3.  混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。
4.  用2ml無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞，加入0.8ml無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質體復合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中37℃孵育2-24hr。
5.  用*培養(yǎng)基替換轉染液，繼續(xù)培養(yǎng)。
6.  24-72hr后檢測蛋白質的表達或傳代并加入選擇性抗生素以篩選穩(wěn)定表達株。