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深圳市安培生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第5年
部分分解多肽兩端有關(guān)的 PCR 法篩選 PK-120 基因?qū)嶒?yàn)2022/03/24
材料與儀器PK-120Sephadex-50GeneAmpRNAPCR試劑盒合成寡聚核苷酸抽提液酵母tRNAPCR擴(kuò)增儀步驟實(shí)驗(yàn)所需「試劑」具體見(jiàn)「其他」1.引物設(shè)計(jì)PK-120部分分解多肽氨基酸序列中，最長(zhǎng)序列K-15，16為引物設(shè)計(jì)的依據(jù)：1.1考慮全部編碼的組合，1.2考慮人編碼的使用頻率，設(shè)計(jì)PCR引物，正義鏈及反義鏈如用這些引物獲得的PCR產(chǎn)物當(dāng)中，50bp的產(chǎn)物為目的cDNA。2.PCR擴(kuò)增從肝臟來(lái)源的poly（A）+RNA中，用GeneAmpRNAPCR試劑盒如以下所述，合成cDN
標(biāo)簽酶消化釋放標(biāo)簽實(shí)驗(yàn)2022/03/24
材料與儀器溶液與緩沖液LoTEEppendorf試管步驟實(shí)驗(yàn)方案A1.向含有Dynabeads的每個(gè)試管中加入下列物質(zhì)：2.65℃下酶解Ih(每IOmin混合1次)。3.時(shí)收集上清液（含有釋放的cDNA標(biāo)簽）4.用LoTE擴(kuò)容到200mL。5.等體積的PCI抽提，乙醇沉淀（實(shí)驗(yàn)方案A，第2步）。6.將沖洗和風(fēng)干后的沉淀重新懸浮于10ulLoTE中。實(shí)驗(yàn)方案B1.從PCR試管中移去連接反應(yīng)混合物并用50ul洗液洗滌1次。2.從試管中移去沖洗液，加入50ul的1X限制性緩沖液，然后移去限制性緩沖液。
Biozellen植物源基質(zhì)膠在小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)的使用步驟2022/03/23
小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序A、細(xì)胞房?jī)?nèi)材料準(zhǔn)備、試劑制備及步驟(1)材料準(zhǔn)備:1.冰盒、2.37℃水浴槽、3.C緩沖溶液(10X)、4.無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液(例如:無(wú)血清DMEM，DMEM-F12等，不可用PBS)、5.A膠(2X)、6.細(xì)胞培養(yǎng)液、7.23-26G針頭、8.1mL針筒、9.細(xì)胞。(2)試劑制備:1、C緩沖溶液(0.5X)制備:使用37℃水浴回溫的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液(例如:無(wú)血清DMEM或DMEM-F12等，不可用PBS)稀釋C緩沖溶液(10X)至C緩沖溶液(0.5X),即體積稀釋20倍
Biozellen基質(zhì)膠在3D細(xì)胞球體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用操作2022/03/23
Biozellen®3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠在3D細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗(yàn)步驟：A、試劑制備1、A基質(zhì)膠：將A基質(zhì)膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*融解.2、C緩沖溶液(1X)制備：使用前將10XC緩沖溶液用冰的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液(例如：無(wú)血清DMEM、opt-MEM)制備成1XC緩沖溶液。(不要用PBS稀釋C緩沖液).3、D緩沖溶液(1X)制備:使用前用冷的1xPBS稀釋10XD緩沖溶液至1XD緩沖溶液.B、Biozellen®3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備全部步驟需要在無(wú)菌環(huán)境內(nèi)操作，操作步驟如下：1、將24孔培
Biozellen基質(zhì)膠在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的操作方法2022/03/22
細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序A、試劑準(zhǔn)備:1、C緩沖溶液(0.5X)制備:使用37℃水浴回溫的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液(例如:無(wú)血清DMEM等，用于稀釋A膠)稀釋C緩沖溶液(10X)(貨號(hào):B-P-00002-C)至C緩沖溶液(0.5X),即體積稀釋20倍。使用前放置37度水浴槽。(例如:1mLC緩沖溶液(10X)+19ml無(wú)血清DMEM;如未使用完畢，可保存于4℃冰箱,保存一周)2、A膠(1X)制備:將A膠(2X)(貨號(hào):B-P-00002-A)置于37℃水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*溶解。再將37℃水浴回溫的無(wú)
基質(zhì)膠斷貨了，實(shí)驗(yàn)怎么辦？Biozellen®3D基質(zhì)膠解您燃眉之急！2022/03/21
▲B(niǎo)iozellen®3D基質(zhì)膠傳統(tǒng)動(dòng)物源基質(zhì)膠是一種從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜基質(zhì)，其用于細(xì)胞培養(yǎng)已有30多年歷史。然而，由于其動(dòng)物源的成分復(fù)雜和存在人畜共通病原菌或毒素風(fēng)險(xiǎn)等許多未知性，傳統(tǒng)動(dòng)物源基質(zhì)膠在細(xì)胞生物學(xué)、治療性細(xì)胞制造和藥物開(kāi)發(fā)方面的適用性受到限制。傳統(tǒng)動(dòng)物源基質(zhì)膠批次之間性質(zhì)的差異導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)易出現(xiàn)不確定性和重現(xiàn)性差的問(wèn)題，研究人員通常需要對(duì)同一批次基質(zhì)膠進(jìn)行大批量“囤貨”。此外，傳統(tǒng)基質(zhì)膠操作條件嚴(yán)苛復(fù)雜，難以調(diào)整凝膠性質(zhì)
免疫組化IHC實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)2022/03/15
1、免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最為常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中最佳的組織標(biāo)本制作方法。2、石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛
細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)-CCK-8 法2022/03/15
實(shí)驗(yàn)原理：CellCountingKit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。一、用途
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析法2022/03/14
摘要：介紹5種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析法：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析法、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析法、體外轉(zhuǎn)錄分析法、轉(zhuǎn)基因分析法和同源重組分析法.1.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析法目前有很多功能性分析方法用于研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控尤為常用的方法是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析法.該方法是通過(guò)一定的轉(zhuǎn)染程序?qū)⒑康恼{(diào)控區(qū)的質(zhì)粒導(dǎo)人培養(yǎng)細(xì)胞.在典型情況下,調(diào)控區(qū)調(diào)控“報(bào)告基因”的轉(zhuǎn)錄.報(bào)告基因是在mRNA和蛋白質(zhì)的水平上都易于被正確檢測(cè)到的基因.產(chǎn)生的質(zhì)粒在培養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后,在特定時(shí)刻測(cè)定從報(bào)告基因上合成的mRNA或蛋白質(zhì),以評(píng)價(jià)調(diào)控區(qū)的活性.人們將這種分析方法稱為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析,
細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）2022/03/14
常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永（jiu）轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超
細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染2022/03/14
摘要：通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電穿孔等基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將靶基因?qū)爰?xì)胞，一般在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)左右，靶基因即可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?8小時(shí)后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。原理：通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電穿孔等基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將靶基因?qū)爰?xì)胞，一般在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)左右，靶基因即可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?8小時(shí)后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用：觀察目的基因及其表達(dá)蛋白在某種細(xì)胞中的功能（短時(shí)間即可進(jìn)行觀察，但效應(yīng)會(huì)很快丟失）。一般流程：1）細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種
哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)移法制備重組蛋白實(shí)驗(yàn)2022/03/14
材料與儀器步驟一、轉(zhuǎn)染方法對(duì)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Upofection),可以從商業(yè)途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的專（禾刂）化組分，而且毫無(wú)疑問(wèn)，它們中的大部分都能非常有效地將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)人細(xì)胞。其缺點(diǎn)是價(jià)格不菲—-在使用這些試劑時(shí)，對(duì)于超出數(shù)百毫升規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，經(jīng)濟(jì)上是不可行的。大規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法要求轉(zhuǎn)染試劑能很容易大量獲取,批次間的變化小以保證轉(zhuǎn)染的一致性。盡管也存在一些其他的選擇，如將殼聚糖(chitosan)及其衍生物和14DEA2作為轉(zhuǎn)染試劑（DangａndLeong,2006;J
斑點(diǎn)濾膜結(jié)合法2022/03/14
原理材料與儀器待測(cè)蛋白質(zhì)樣品10％三氯醋酸（TCA）考馬斯亮藍(lán)凝膠染色液考馬斯亮藍(lán)凝膠脫色液Whatman3MM濾紙步驟1.用鉛筆在3mm濾紙上畫(huà)出1cmx1cm大小的方格；2.在每一方格中心加入3ul樣品；3.將濾紙涼干，大約需要15min；4.將濾紙浸入10％TCA溶液中30s（TCA溶液可重復(fù)使用）；5.用水快速漂洗濾紙；6.將濾紙浸入考馬斯亮藍(lán)凝膠染液中30s（染液可重復(fù)使用）；7.用水快速漂洗濾紙；8.在考馬斯亮藍(lán)凝膠脫色液中使濾紙脫色，脫色在幾分鐘之內(nèi)完成；9.通過(guò)相應(yīng)顯藍(lán)色的方格，
Real-time PCR實(shí)驗(yàn)攻略（基本方法二）2022/03/11
材料與儀器一、關(guān)于TrizolReagent需要的試劑1.Chloroform：氯仿(分析純)2.Isoproplylalcohol：異丙醇(分析純)3.75%Ethanol（inDEPC-treatedwater）:75%乙醇。要求用分析純無(wú)水乙醇并用0.01%的DEPC處理過(guò)的無(wú)Rnase的水稀釋。4.RNase-freewater：無(wú)Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500ml（50ul），在37℃過(guò)夜，并高壓滅菌即得（150℃3小時(shí)）5.一次性塑料手套
T、B淋巴細(xì)胞分離2022/03/11
原理淋巴細(xì)胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡(jiǎn)稱AET）處理的綿羊紅細(xì)胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細(xì)胞均能吸附AET-SRBC，形成牢固穩(wěn)定而巨大的E-花環(huán)，較正常未處理的SRBC形成的E-花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離時(shí)，AET-E花環(huán)易沉于管底，而未形成E-花環(huán)的T淋巴細(xì)胞，用低滲液解花環(huán)周圍的AET-SRBC，便可獲得純T淋巴細(xì)胞，而B(niǎo)淋巴細(xì)胞可直接取自分層液的界面。材料與儀器新鮮豚鼠血Hanks液小牛血清199培養(yǎng)液生理鹽水氯化鈉溶液離心管離心
Real-time PCR實(shí)驗(yàn)攻略（基本方法一）2022/03/11
材料與儀器步驟實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）實(shí)驗(yàn)流程一、RNA的提取(詳見(jiàn)RNA提取及反轉(zhuǎn)錄)不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因?yàn)镽eal-TimePCR對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實(shí)驗(yàn)前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂；取2ug進(jìn)行RNA的甲醛變性膠電泳檢測(cè)，如果存在DNA污染時(shí)，要用DNaseI進(jìn)行消化（因?yàn)樵谔幚磉^(guò)程中RNA極易降解，建議體系中加入適量R
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)2022/03/11
原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。材料與儀器細(xì)胞樣品RNA提取試劑盒熒光定量PCRMixTRIZOLdNTP氯仿逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV異丙醇Taq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2瓊脂糖溴化乙錠MOPS甲醛乙酸鈉EDTAEB溴酚蘭離心管離心機(jī)風(fēng)光光度計(jì)電泳槽凝膠板RealtimePCR儀步驟一、樣品RNA的抽提1.取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。2.兩相分離每1ml的TR
補(bǔ)體介導(dǎo)法2022/03/11
原理帶有特異抗原的靶細(xì)胞（如正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補(bǔ)體的參與下，引起靶細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加、細(xì)胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺(tái)盼藍(lán)）可通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞著色，故可用于指示死細(xì)胞或?yàn)l死細(xì)胞，而活細(xì)胞不著色。此即補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒試驗(yàn)，利用細(xì)胞毒試驗(yàn)可以檢查細(xì)胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。本實(shí)驗(yàn)中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細(xì)胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過(guò)補(bǔ)體的協(xié)同作用，可殺傷95%以上的胸腺細(xì)胞。材料與儀器C57B
輔助方案 TCA 沉淀測(cè)定標(biāo)記摻入量2022/03/10
原理材料與儀器被標(biāo)記的細(xì)胞懸液（見(jiàn)基本方案或備擇方案1～4）0.1％（mV）BSA／0.02%（mV）NaN310%TCA溶液冷凍乙醇連接真空管道的濾過(guò)裝置2.5cm玻璃微纖維濾膜（WhatmanGF／C）步驟1.加10～20μl被標(biāo)記的細(xì)胞懸液到0.1ml0.1％（m/V）BSA/0.02％（m/V）NaN3中，置于冰上。2.加1ml冷凍的10％（m/V）TCA溶液。劇烈振蕩混勻，在冰上孵育30min。3.在真空濾過(guò)裝置內(nèi)，濾過(guò)細(xì)胞懸液到2.5cm玻璃微纖維濾膜上。4.用5ml冷凍10％TCA
備擇方案 3 長(zhǎng)期細(xì)胞標(biāo)記2022/03/10
原理長(zhǎng)期標(biāo)記意味著對(duì)細(xì)胞進(jìn)行6～32h持續(xù)的代謝標(biāo)記。該方法特別適用于研究合成速度相對(duì)較慢的蛋白質(zhì)或研究成熟的標(biāo)記蛋白而不是生物合成的前體。穩(wěn)定狀態(tài)的標(biāo)記是長(zhǎng)期標(biāo)記的一種形式，在此過(guò)程細(xì)胞和放射性標(biāo)記的氨基酸一起孵育直至放射性標(biāo)記蛋白的合成和降解速率相當(dāng)。如果蛋白質(zhì)復(fù)合體中的亞基的初級(jí)結(jié)構(gòu)已知，該方法可以對(duì)這些亞單位進(jìn)行化學(xué)計(jì)量。所加入的未標(biāo)記的甲硫氨酸量依賴于某些因素，如標(biāo)記的時(shí)間和細(xì)胞濃度。通常使用的培養(yǎng)基中含有5％～20％正常的非標(biāo)記甲硫氨酸含量。材料與儀器細(xì)胞懸液／貼壁細(xì)胞[35S]標(biāo)記
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