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部分分解多肽兩端有關的 PCR 法篩選 PK-120 基因實驗2022/03/24

材料與儀器PK-120Sephadex-50GeneAmpRNAPCR試劑盒合成寡聚核苷酸抽提液酵母tRNAPCR擴增儀步驟實驗所需「試劑」具體見「其他」1.引物設計PK-120部分分解多肽氨基酸序列中，最長序列K-15，16為引物設計的依據(jù)：1.1考慮全部編碼的組合，1.2考慮人編碼的使用頻率，設計PCR引物，正義鏈及反義鏈如用這些引物獲得的PCR產物當中，50bp的產物為目的cDNA。2.PCR擴增從肝臟來源的poly（A）+RNA中，用GeneAmpRNAPCR試劑盒如以下所述，合成cDN

標簽酶消化釋放標簽實驗2022/03/24

材料與儀器溶液與緩沖液LoTEEppendorf試管步驟實驗方案A1.向含有Dynabeads的每個試管中加入下列物質：2.65℃下酶解Ih(每IOmin混合1次)。3.時收集上清液（含有釋放的cDNA標簽）4.用LoTE擴容到200mL。5.等體積的PCI抽提，乙醇沉淀（實驗方案A，第2步）。6.將沖洗和風干后的沉淀重新懸浮于10ulLoTE中。實驗方案B1.從PCR試管中移去連接反應混合物并用50ul洗液洗滌1次。2.從試管中移去沖洗液，加入50ul的1X限制性緩沖液，然后移去限制性緩沖液。

Biozellen植物源基質膠在小鼠皮下成瘤實驗的使用步驟2022/03/23

小鼠皮下成瘤實驗準備程序A、細胞房內材料準備、試劑制備及步驟(1)材料準備:1.冰盒、2.37℃水浴槽、3.C緩沖溶液(10X)、4.無血清細胞培養(yǎng)液(例如:無血清DMEM，DMEM-F12等，不可用PBS)、5.A膠(2X)、6.細胞培養(yǎng)液、7.23-26G針頭、8.1mL針筒、9.細胞。(2)試劑制備:1、C緩沖溶液(0.5X)制備:使用37℃水浴回溫的無血清細胞培養(yǎng)液(例如:無血清DMEM或DMEM-F12等，不可用PBS)稀釋C緩沖溶液(10X)至C緩沖溶液(0.5X),即體積稀釋20倍

Biozellen基質膠在3D細胞球體培養(yǎng)實驗的應用操作2022/03/23

Biozellen®3D細胞培養(yǎng)基質膠在3D細胞球體培養(yǎng)試驗步驟：A、試劑制備1、A基質膠：將A基質膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘，確認*融解.2、C緩沖溶液(1X)制備：使用前將10XC緩沖溶液用冰的無細胞培養(yǎng)液(例如：無血清DMEM、opt-MEM)制備成1XC緩沖溶液。(不要用PBS稀釋C緩沖液).3、D緩沖溶液(1X)制備:使用前用冷的1xPBS稀釋10XD緩沖溶液至1XD緩沖溶液.B、Biozellen®3D細胞培養(yǎng)基質膠的制備全部步驟需要在無菌環(huán)境內操作，操作步驟如下：1、將24孔培

Biozellen基質膠在細胞侵襲實驗的操作方法2022/03/22

細胞侵襲實驗準備程序A、試劑準備:1、C緩沖溶液(0.5X)制備:使用37℃水浴回溫的無血清細胞培養(yǎng)液(例如:無血清DMEM等，用于稀釋A膠)稀釋C緩沖溶液(10X)(貨號:B-P-00002-C)至C緩沖溶液(0.5X),即體積稀釋20倍。使用前放置37度水浴槽。(例如:1mLC緩沖溶液(10X)+19ml無血清DMEM;如未使用完畢，可保存于4℃冰箱,保存一周)2、A膠(1X)制備:將A膠(2X)(貨號:B-P-00002-A)置于37℃水浴槽回溫10分鐘，確認*溶解。再將37℃水浴回溫的無

基質膠斷貨了，實驗怎么辦？Biozellen®3D基質膠解您燃眉之急！2022/03/21

▲Biozellen®3D基質膠傳統(tǒng)動物源基質膠是一種從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜基質，其用于細胞培養(yǎng)已有30多年歷史。然而，由于其動物源的成分復雜和存在人畜共通病原菌或毒素風險等許多未知性，傳統(tǒng)動物源基質膠在細胞生物學、治療性細胞制造和藥物開發(fā)方面的適用性受到限制。傳統(tǒng)動物源基質膠批次之間性質的差異導致相關細胞培養(yǎng)實驗易出現(xiàn)不確定性和重現(xiàn)性差的問題，研究人員通常需要對同一批次基質膠進行大批量“囤貨”。此外，傳統(tǒng)基質膠操作條件嚴苛復雜，難以調整凝膠性質

免疫組化IHC實驗經驗總結2022/03/15

1、免疫組化實驗所用的組織和細胞標本有哪些？實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本最為常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中最佳的組織標本制作方法。2、石蠟切片為什么要做抗原修復？有哪些方法？石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛

細胞增殖與毒性檢測實驗方法及經驗總結-CCK-8 法2022/03/15

實驗原理：CellCountingKit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。一、用途

瞬時轉染分析法2022/03/14

摘要：介紹5種瞬時轉染分析法：瞬時轉染分析法、穩(wěn)定轉染分析法、體外轉錄分析法、轉基因分析法和同源重組分析法.1.瞬時轉染分析法目前有很多功能性分析方法用于研究轉錄調控尤為常用的方法是瞬時轉染分析法.該方法是通過一定的轉染程序將含目的調控區(qū)的質粒導人培養(yǎng)細胞.在典型情況下,調控區(qū)調控“報告基因”的轉錄.報告基因是在mRNA和蛋白質的水平上都易于被正確檢測到的基因.產生的質粒在培養(yǎng)細胞中轉錄后,在特定時刻測定從報告基因上合成的mRNA或蛋白質,以評價調控區(qū)的活性.人們將這種分析方法稱為瞬時轉染分析,

細胞轉染技術原理及應用（瞬時轉染和穩(wěn)定轉染）2022/03/14

常規(guī)轉染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩(wěn)定轉染（永（jiu）轉染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24-72小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超

細胞瞬時轉染2022/03/14

摘要：通過脂質體介導轉染法及電穿孔等基因轉染技術，將靶基因導入細胞，一般在轉染后48小時左右，靶基因即可在細胞內表達。根據(jù)不同的實驗目的，48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。原理：通過脂質體介導轉染法及電穿孔等基因轉染技術，將靶基因導入細胞，一般在轉染后48小時左右，靶基因即可在細胞內表達。根據(jù)不同的實驗目的，48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。應用：觀察目的基因及其表達蛋白在某種細胞中的功能（短時間即可進行觀察，但效應會很快丟失）。一般流程：1）細胞接種：轉染實驗前天接種細胞，各種

哺乳動物細胞瞬時基因轉移法制備重組蛋白實驗2022/03/14

材料與儀器步驟一、轉染方法對于脂質體轉染(Upofection),可以從商業(yè)途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的專（禾刂）化組分，而且毫無疑問，它們中的大部分都能非常有效地將質粒DNA轉人細胞。其缺點是價格不菲—-在使用這些試劑時，對于超出數(shù)百毫升規(guī)模的瞬時轉染，經濟上是不可行的。大規(guī)模的瞬時轉染方法要求轉染試劑能很容易大量獲取,批次間的變化小以保證轉染的一致性。盡管也存在一些其他的選擇，如將殼聚糖(chitosan)及其衍生物和14DEA2作為轉染試劑（DangａndLeong,2006;J

斑點濾膜結合法2022/03/14

原理材料與儀器待測蛋白質樣品10％三氯醋酸（TCA）考馬斯亮藍凝膠染色液考馬斯亮藍凝膠脫色液Whatman3MM濾紙步驟1.用鉛筆在3mm濾紙上畫出1cmx1cm大小的方格；2.在每一方格中心加入3ul樣品；3.將濾紙涼干，大約需要15min；4.將濾紙浸入10％TCA溶液中30s（TCA溶液可重復使用）；5.用水快速漂洗濾紙；6.將濾紙浸入考馬斯亮藍凝膠染液中30s（染液可重復使用）；7.用水快速漂洗濾紙；8.在考馬斯亮藍凝膠脫色液中使濾紙脫色，脫色在幾分鐘之內完成；9.通過相應顯藍色的方格，

Real-time PCR實驗攻略（基本方法二）2022/03/11

材料與儀器一、關于TrizolReagent需要的試劑1.Chloroform：氯仿(分析純)2.Isoproplylalcohol：異丙醇(分析純)3.75%Ethanol（inDEPC-treatedwater）:75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。4.RNase-freewater：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500ml（50ul），在37℃過夜，并高壓滅菌即得（150℃3小時）5.一次性塑料手套

T、B淋巴細胞分離2022/03/11

原理淋巴細胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡稱AET）處理的綿羊紅細胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細胞均能吸附AET-SRBC，形成牢固穩(wěn)定而巨大的E-花環(huán)，較正常未處理的SRBC形成的E-花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復性好。再經淋巴細胞分層液分離時，AET-E花環(huán)易沉于管底，而未形成E-花環(huán)的T淋巴細胞，用低滲液解花環(huán)周圍的AET-SRBC，便可獲得純T淋巴細胞，而B淋巴細胞可直接取自分層液的界面。材料與儀器新鮮豚鼠血Hanks液小牛血清199培養(yǎng)液生理鹽水氯化鈉溶液離心管離心

Real-time PCR實驗攻略（基本方法一）2022/03/11

材料與儀器步驟實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）實驗流程一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉錄)不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-TimePCR對RNA樣品的質量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；取2ug進行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時，要用DNaseI進行消化（因為在處理過程中RNA極易降解，建議體系中加入適量R

實時熒光定量PCR技術2022/03/11

原理實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。材料與儀器細胞樣品RNA提取試劑盒熒光定量PCRMixTRIZOLdNTP氯仿逆轉錄酶MMLV異丙醇Taq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2瓊脂糖溴化乙錠MOPS甲醛乙酸鈉EDTAEB溴酚蘭離心管離心機風光光度計電泳槽凝膠板RealtimePCR儀步驟一、樣品RNA的抽提1.取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。2.兩相分離每1ml的TR

補體介導法2022/03/11

原理帶有特異抗原的靶細胞（如正常細胞、腫瘤細胞、病毒感染細胞）與相應抗體結合后，在補體的參與下，引起靶細胞膜損傷，導致細胞膜的通透性增加、細胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺盼藍）可通過細胞膜進入細胞內使細胞著色，故可用于指示死細胞或瀕死細胞，而活細胞不著色。此即補體依賴性細胞毒試驗，利用細胞毒試驗可以檢查細胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。本實驗中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協(xié)同作用，可殺傷95%以上的胸腺細胞。材料與儀器C57B

輔助方案 TCA 沉淀測定標記摻入量2022/03/10

原理材料與儀器被標記的細胞懸液（見基本方案或備擇方案1～4）0.1％（mV）BSA／0.02%（mV）NaN310%TCA溶液冷凍乙醇連接真空管道的濾過裝置2.5cm玻璃微纖維濾膜（WhatmanGF／C）步驟1.加10～20μl被標記的細胞懸液到0.1ml0.1％（m/V）BSA/0.02％（m/V）NaN3中，置于冰上。2.加1ml冷凍的10％（m/V）TCA溶液。劇烈振蕩混勻，在冰上孵育30min。3.在真空濾過裝置內，濾過細胞懸液到2.5cm玻璃微纖維濾膜上。4.用5ml冷凍10％TCA

備擇方案 3 長期細胞標記2022/03/10

原理長期標記意味著對細胞進行6～32h持續(xù)的代謝標記。該方法特別適用于研究合成速度相對較慢的蛋白質或研究成熟的標記蛋白而不是生物合成的前體。穩(wěn)定狀態(tài)的標記是長期標記的一種形式，在此過程細胞和放射性標記的氨基酸一起孵育直至放射性標記蛋白的合成和降解速率相當。如果蛋白質復合體中的亞基的初級結構已知，該方法可以對這些亞單位進行化學計量。所加入的未標記的甲硫氨酸量依賴于某些因素，如標記的時間和細胞濃度。通常使用的培養(yǎng)基中含有5％～20％正常的非標記甲硫氨酸含量。材料與儀器細胞懸液／貼壁細胞[35S]標記