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高保真DNA聚合酶究竟有哪些魔力呢？2021/09/26

作用原理高保真DNA聚合酶含有聚合中心和酶切中心[1]，聚合中心具有5’-3’聚合酶活性，負(fù)責(zé)聚合作用；酶切中心具有3’-5’外切酶活性（也稱校對活性），負(fù)責(zé)將不配對的核苷酸予以切除。在PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)引物與模板*互補(bǔ)后，進(jìn)入聚合中心，在聚合酶活性作用下，游離的脫氧核苷酸通過互補(bǔ)配對原則，依次結(jié)合到引物的3’端，新鏈DNA從5’到3’進(jìn)行延伸（圖1-a）；當(dāng)引物末端結(jié)合的核苷酸與模板不配對時（圖1-b），錯配的核苷酸會翹起，新鏈DNA無法繼續(xù)向前延伸，進(jìn)而進(jìn)入酶切中心，在外切酶活性作用下，錯

細(xì)胞培養(yǎng)之真菌細(xì)菌污染的防治方法2021/09/24

請遵守細(xì)胞污染永恒定律：無論什么細(xì)胞只要是不重要的細(xì)胞污染了，立刻加84棄之，重新復(fù)蘇新凍存管培養(yǎng)；實在需要挽救的請參考以下：細(xì)菌污染：主要有洋蔥霍爾伯德菌型污染確定是非常珍貴的細(xì)胞建議分別配置含10倍慶大霉素和兩性霉素溶液（G/A)的PBS和5倍慶大霉素和兩性霉素溶液（G/A)的*培養(yǎng)基各一份。然后先用10倍雙抗的PBS洗滌細(xì)胞5-10次，然后用5倍雙抗的*培養(yǎng)洗滌細(xì)胞3次以上,再加上含雙倍的G/A溶液放培養(yǎng)箱培養(yǎng)，一個小時后換液，持續(xù)4個小時后，再加上正常培養(yǎng)細(xì)胞所需的抗生素，過夜，到最終確

干貨分享：常用的實驗室溶劑配方！2021/09/24

一到配試劑的時候，各種算法就來了，數(shù)學(xué)，分子原理齊上陣，腦袋還是好大，稍微不注意，前功盡棄，于是我們整理了一些常規(guī)的實驗室配制方法，供大家參考：常用試劑配方1mol/L亞精胺（Spermidine）:溶解2.55g亞精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。10mol/L乙酸胺（ammoniumacetate）：將77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔徑的濾膜過濾除菌。10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（組分V或分子生物學(xué)試

細(xì)胞轉(zhuǎn)染率低，轉(zhuǎn)染試劑要全背鍋嗎？2021/09/24

目前細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為三大類：化學(xué)法、物理法及生物學(xué)法。但是沒有一種方法是通用并且準(zhǔn)確無誤的，所以只有依據(jù)自己的實驗要求或者實驗探索選擇理想的方法，才能獲得漂亮的實驗結(jié)果。當(dāng)然也可以在前輩們發(fā)的文獻(xiàn)中多看看，前車之鑒可以減少很多不必要的花費。細(xì)胞轉(zhuǎn)染低都是轉(zhuǎn)染試劑的問題嗎？純度不夠確實會有這樣的問題，所以選擇轉(zhuǎn)染試劑很重要，其次還需要考慮以下幾點影響：1.其他微生物污染您覺得您養(yǎng)的細(xì)胞，不，不，不，可能您只知道您養(yǎng)的是細(xì)胞，你不知道的是您的細(xì)胞可能背著您養(yǎng)了一群小三，比如支原體，病毒，黑膠蟲等

怎么預(yù)防支原體，看看米高梅科學(xué)家怎么說（下）2021/09/24

這篇文章KaustubhKishorJadhav撰寫的，今天接著把續(xù)集寫完，劃重點，續(xù)集真的很重要，因為都是滿滿告訴您怎么對付和清除支原體的干貨。避免支原體感染的最好和最重要的方法是為實驗室工作人員提供適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)和指導(dǎo)。這可以通過培訓(xùn)合格的員工進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，從而消除污染的原因之一。如果可能的話，應(yīng)該為細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持提供一個單獨的實驗室。為實驗室提供這樣的環(huán)境不僅可以減少支原體，而且可以避免其他細(xì)菌和真菌污染。合適的個人防護(hù)用品很重要由于人類是污染的主要來源，預(yù)防步驟從你開始。如果你足夠小

怎么預(yù)防支原體——看米高梅科學(xué)家怎么說（上）2021/09/24

這篇文章KaustubhKishorJadhav撰寫的，今天先分享的是他的上一段，關(guān)于細(xì)胞支原體污染的原因和怎么檢測細(xì)胞支原體污染，他是米高梅生物科學(xué)與技術(shù)研究所的研究助理。如果你正在閱讀這篇文章，如果你的實驗室里有支原體，不要驚訝。因為它們存在于大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施、組織培養(yǎng)實驗室中，是每個細(xì)胞培養(yǎng)工作者必須解決的問題。據(jù)估計，高達(dá)60%的細(xì)胞培養(yǎng)污染是支原體污染（Uphoff，2002年統(tǒng)計）。支原體被認(rèn)為是最是簡單、最小的細(xì)菌之一。缺乏堅硬的細(xì)胞壁使它們對抗生素和抗菌藥物如青霉素和鏈霉素產(chǎn)生

干貨分享：動物過繼法去除支原體步驟2021/09/23

細(xì)胞長著長著然后越來越慢，然后隨便你加什么它就在那里，不增不長，甚至還翻個白眼給你看，可能是支原體感染了怎么辦？可以試試動物過繼法（可動物成瘤細(xì)胞的福音）:1.取3只4-5周齡BALB/c裸鼠，每只于右側(cè)腋下皮下接種可成瘤的細(xì)胞，待腫瘤平均體積長至約1.0X1.0X1.0cm3時，得到荷瘤小鼠。將荷瘤小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%(體積百分比濃度)的乙醇水溶液中3-5min，得到消毒后的小鼠；在超凈工作臺內(nèi)，用無菌剪刀和無菌鑷子從消毒后的小鼠胸口剪開小鼠皮膚，小心剝離得到腫瘤組織。用眼科剪稍微剪

3D細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟2021/09/23

體外三維細(xì)胞建模和成像是候選分子毒性評估的一個有價值的早期步驟，3D細(xì)胞培養(yǎng)很大程度上可檢測臨床前藥物開發(fā)工作流程，包括在細(xì)胞、組織、器官和整個有機(jī)體的迭代更高生物水平上的毒性評估。在這些層次上建模和成像的能力是分子評估和發(fā)展的強(qiáng)大工具。3D細(xì)胞培養(yǎng)中的單個細(xì)胞提供了關(guān)于分子亞細(xì)胞對一般細(xì)胞功能的影響的數(shù)據(jù)，如細(xì)胞生長速度。3D細(xì)胞培養(yǎng)也用于評估特定細(xì)胞類型的毒性，提供組織和器官功能的數(shù)據(jù)。3D細(xì)胞培養(yǎng)允許細(xì)胞生長，培養(yǎng)物向各個方向擴(kuò)展，從而模擬自然的微結(jié)構(gòu)。這種類型的培養(yǎng)提供了對分子對細(xì)胞間相

有趣的細(xì)胞冷知識2021/09/23

1.人體細(xì)胞都很小嗎？答案是否定的，比如說星形膠質(zhì)細(xì)胞，它的胞體上有著長長的軸突，長度甚至可達(dá)一米；（jing）子是人體內(nèi)最小的細(xì)胞，只有不到3微米，而卵子卻有140微米。2.人體免疫細(xì)胞過多是好事嗎？NO，他們會內(nèi)訌，會打的誰也不認(rèn)識誰，結(jié)果受傷的只有你自己，比如說強(qiáng)直性脊柱炎，自身免疫病等大部分都是免疫細(xì)胞過多造成的；3.人體細(xì)胞也有“七年之癢”？科學(xué)的解釋是：因為人體在不斷地新陳代謝，細(xì)胞會每七年全部更新，擁有一個全新的身體，但是為什么更新后人也在不斷的老去，這是因為每更新一次，細(xì)胞自身的

凍存細(xì)胞的這些坑，你踩過嗎？2021/09/23

凍存細(xì)胞的錯誤時機(jī)主要有：細(xì)胞量太少，細(xì)胞狀態(tài)不好，細(xì)胞變形嚴(yán)重，或者細(xì)胞生長堆積，一旦生長過平頂期，培養(yǎng)基就會變得很黃，細(xì)胞可疑污染；鏡下觀察細(xì)胞有很多碎片或者不明物；培養(yǎng)時間過長，連續(xù)培養(yǎng)超過二個月，細(xì)胞性狀已有改變。選擇細(xì)胞凍存的最佳時機(jī)：細(xì)胞增殖旺盛，情況穩(wěn)定，試驗效果良好，復(fù)蘇后兩周內(nèi)開始凍存一批，再往下傳的用來做實驗。細(xì)胞太少凍存時細(xì)胞濃度低于1-5*10^5CELL/VIAL,復(fù)蘇很難成功,原因：細(xì)胞和細(xì)胞間會又間隙接觸反應(yīng),解決：離心后調(diào)整細(xì)胞濃度，把細(xì)胞種更小的孔板中.培養(yǎng)基很

常見細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制方法分享2021/09/23

培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項操作過程中所需的基本溶液。常用的細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括：超純水，平衡鹽溶液，消化液，PH調(diào)整液，谷氨酰胺溶液，抗生素溶液。常見的超純水1.使用純水機(jī)純化而來；2.蒸餾水和離子交換水3.三蒸水平衡鹽溶液1、平衡鹽溶液主要由無機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。2、D-Hank’s與Hank’s的一個主要區(qū)別在于前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank’

細(xì)胞培養(yǎng)無小事，需注意的四個事項！2021/09/22

培養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如MEM）和添加劑（血清或細(xì)胞生長因子）組成，培養(yǎng)基的配方都會隨著細(xì)胞需要的營養(yǎng)不斷的改進(jìn)，而抗生素也是，廣譜抗生素使用太多，會導(dǎo)致細(xì)胞的耐受性提高，從而產(chǎn)生抗性，甚至有些老師為了實驗的精確性，選擇不用抗生素培養(yǎng)細(xì)胞。一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基絕大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎(chǔ)上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養(yǎng)物質(zhì)，生物學(xué)最是通用的培養(yǎng)基是Dulbecco`s改良培養(yǎng)基——DMEM，同MEM含有相同的營養(yǎng)成分，但濃度高出2~4倍。細(xì)胞培養(yǎng)選擇

如何通過細(xì)節(jié)挑選血清？2021/09/22

體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)無任何抵抗力，挑選血清是一個很艱難的決定，有些血清可能前期養(yǎng)細(xì)胞沒有看到多大的問題，但是養(yǎng)著養(yǎng)著細(xì)胞突然暴斃，之前我們一直以為是細(xì)胞或者培養(yǎng)基的問題，后來給血清做完質(zhì)譜之后，發(fā)現(xiàn)血清里含有的生長激素竟然是人體可以承受的幾倍；以下我們分享一些挑選血清的細(xì)節(jié)：首先，我們來看血清的成分及主要作用：(1)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)(2)提供貼壁和擴(kuò)展因子(3)提供激素及各種生長因子(4)提供結(jié)合蛋白(5)對培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用怎么挑選血清：判斷血清質(zhì)量首先從外觀入手

分享哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的9個基本技巧！2021/09/22

一、凈化空氣在開始任何組織培養(yǎng)工作之前，打開新風(fēng)系統(tǒng)至少15分鐘，確保有清潔的空氣流入。要始終確保沒有任何東西覆蓋它。每周打開紫外線燈3-4次，最多半個小時，可以幫助保持你的實驗室無污染，但你應(yīng)該記住，紫外線只會殺死它直接照射到的微生物。紫外線照射對眼睛和皮膚也是有害的，所以在使用遮光罩時，請保持光線關(guān)閉。在工作前后用消毒劑擦拭超凈臺（大多數(shù)人使用70%的乙醇，但你也可以使用Incidin濕巾）。二、遠(yuǎn)離污染物雖然你很可能是實驗的主要污染源，但是你*有必須要采取你所及的的預(yù)防措施，防止細(xì)胞受到污

怎么培養(yǎng)好的你細(xì)胞？2021/09/22

細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)的主要工具之一，提供研究細(xì)胞正常生理學(xué)和生物化學(xué)的優(yōu)秀模型系統(tǒng)（例如，代謝研究、衰老）、藥物和有毒化合物對細(xì)胞的影響，突變和致癌。它還用于藥物篩選和開發(fā)，以及大規(guī)模生產(chǎn)生物化合物（如疫苗、治療性藥物）match蛋白質(zhì)）。在這些應(yīng)用中使用細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點是通過使用一批試驗獲得的結(jié)果的一致性和再現(xiàn)性克隆細(xì)胞。培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)最重要的組成部分，因為它為細(xì)胞生長提供必要的營養(yǎng)、生長因子和激素，以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值和滲透壓。雖然最初的細(xì)胞培養(yǎng)實驗是使用從組織提取物和體液中獲得

消除細(xì)胞聚團(tuán)就是這么簡單！2021/09/22

當(dāng)在生長培養(yǎng)基中進(jìn)行單懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時，樣本中出現(xiàn)細(xì)胞丟失的情況并不少見。當(dāng)細(xì)胞破裂時，它們會釋放DNA和碎片，導(dǎo)致細(xì)胞聚集成大團(tuán)塊，使其難以擴(kuò)張。細(xì)胞聚團(tuán)既可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，也可引起細(xì)胞死亡。隨著更多的細(xì)胞死亡并釋放碎片，問題將繼續(xù)惡化。盡可能快地處理或避免細(xì)胞聚團(tuán)將有利于實驗的后續(xù)結(jié)果。為什么細(xì)胞聚團(tuán)是個問題？單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基的目標(biāo)是為靶細(xì)胞提供盡可能多的生長資源。這包括充足的生長營養(yǎng)和充足的繁殖空間。當(dāng)細(xì)胞聚集在一起時，它們會相互限制，降低細(xì)胞對營養(yǎng)吞吐量，最終影響生長結(jié)果。細(xì)胞聚團(tuán)也會導(dǎo)致靶

清晰的條帶是這樣跑出來的——western blot八大秘訣！2021/09/17

1.制膠：先制分離膠，再制濃縮膠，嚴(yán)格按照制膠說明書來就可以了。需要注意的一點是制膠一定要混勻！混勻！混勻！個人經(jīng)驗是每加一種試劑，就混勻一下，直到最后一種試劑加完。對于初學(xué)者，還要區(qū)分制膠的玻璃板是1.0cm還是1.5cm的，兩者需要的制膠液體量是不一樣的。另外，玻璃板一定要洗干凈，本人平時都是用洗潔精洗干凈然后用水沖洗最后用純水沖洗，再放在烤箱里烤干并晾至室溫。2.點樣：點樣的過程很簡單，表手抖就OK了。再者，點樣的過程一定迅速，不然前面的樣容易彌散，雖說不至于太影響結(jié)果，但對于有強(qiáng)迫癥的同

如何在WB中順利獲取大分子蛋白？2021/09/17

分子量大于150Ka的蛋白，經(jīng)常折磨我們實驗人。想當(dāng)初，辛辛苦苦忙到深夜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯影空空如也。連續(xù)幾個月如此，內(nèi)心是何等抓狂。當(dāng)大分子條帶第一次出來的時候，心里特別開心，就像見到了初戀情人一樣。看到周圍有同仁受困于大分子蛋白，想一想當(dāng)初所面對的困境。在此,分享一下大分子蛋白的心得，希望這些經(jīng)驗對那些與大分子蛋白奮戰(zhàn)的童鞋提供幫助。提蛋白時應(yīng)加入RIPA強(qiáng)效裂解液，在4℃環(huán)境下靜置的時間延長十分鐘到二十分鐘。這樣可以充分裂解大分子蛋白（裂解不充分，大分子蛋白的電泳速度會很慢）。電泳時，電泳的時間

如何優(yōu)雅地獲得漂亮小分子蛋白條帶2021/09/17

做過Western-Blot的童鞋知道，分子量小于30KDa的蛋白分子不容易做。小分子蛋白虐我千百遍，我待小分子蛋白如初戀。抱怨是沒用的，想方設(shè)法解決問題才是正道。一次又一次的調(diào)整方案，一次又一次的徒勞無功。在此，總結(jié)了小分子蛋白之路經(jīng)驗，供有需求的童鞋參考。一、提蛋白的過程在30分鐘之內(nèi)完成，提完蛋白立即加入上樣緩沖液煮沸（煮沸的時間長一點，一般20分鐘），準(zhǔn)備好蛋白樣品后立即電泳。（小分子蛋白容易形成多聚體，這樣可以大大減少多聚體的形成）。二、電泳時，電泳的時間要足夠長。習(xí)慣是先用60-80

分享總結(jié)Western跑磷酸化蛋白的要點2021/09/17

抗體工欲善其事必先利其器，抗體很關(guān)鍵。這里我們要說的并不是最貴的就是好的，如果條件允許，建議同時購買不同廠家的抗體，一起來試一試，因為有時候即使是好的品牌，不同批次穩(wěn)定性也不一樣?？贵w從訂購到到貨有一定的時間，所以到貨后請盡快分裝好，準(zhǔn)備做實驗，如果實驗進(jìn)度跟不上的問題，導(dǎo)致抗體到了后拖了很久才正式實驗，這樣拖了時間找廠家售后申訴也是很被動的。用CST的一抗，效果不穩(wěn)定，也可能跟抗體放久了有關(guān)。最后買了另一家代理的抗體算是有了比較穩(wěn)定的結(jié)果。當(dāng)然，還是選擇購買口碑較好的公司的產(chǎn)品為佳，這樣即使出