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【技術(shù)】教你如何達(dá)到提取RNA的最高境界！2021/08/31: 免除RNase的困擾RNA分子異常脆弱，很容易就會(huì)被無(wú)處不在的RNase降解，輕輕松松的就讓實(shí)驗(yàn)人員的種種努力付之東流。尤其是當(dāng)樣品極其稀少且珍貴時(shí)，RNA的降解更是讓各位小伙伴們想自掛東南枝。因而RNase可謂是RNA提取的大敵，那么為了保護(hù)好RNA分子，就必須把RNase給KO掉。當(dāng)然針對(duì)外來(lái)的敵人，只要注意這三個(gè)小細(xì)節(jié)，那么絕對(duì)可以克敵制勝。（1）嚴(yán)格戴好口罩、手套。手指和呼吸是外源性RNase的主要來(lái)源，所以在提取RNA時(shí)，一定全副武裝起來(lái)，才好擒獲RNA分子。（2）實(shí)驗(yàn)中所涉及的離心管

RNA Trizol 抽提步驟2021/08/30: PCR、qRT-PCR最最初始，都離不開(kāi)RNA的抽提，RNA質(zhì)量的好壞，直接影響到后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及PCR等過(guò)程。很多時(shí)候，小伙伴們明明跟著Trizol步驟一步一步來(lái)的，謹(jǐn)小慎微，不敢懈怠，但就是RNA抽提不過(guò)關(guān)。其實(shí)Trizol抽提RNA是個(gè)細(xì)活兒，小伙伴們根據(jù)自身的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)，做一下優(yōu)化很有必要~Trizol標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟（打勾勾的自然是要注意的地方）：1、將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5-10min，使得核蛋白與核酸*分離。?樣品中如含有較多的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪或其他細(xì)胞外基質(zhì)，可以12,000rp

【干貨】RNA抽提原理和流程2021/08/30: 現(xiàn)在我們所熟知的TRIzol是LifeTechnologies公司的商品名，而同樣的試劑在PiotrChomczynski創(chuàng)辦的MRC公司則被命名為RNAzol（據(jù)PiotrChomczynski透露，他們已經(jīng)將RNAzol改進(jìn)，使抽提得到的RNA無(wú)基因組DNA殘留）。事實(shí)上，這種RNA抽提的方法應(yīng)該叫做“異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法”。TRIzol作用原理：在勻質(zhì)化或溶解樣品中，TRIzol試劑可保持RNA的完整性，同時(shí)能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后，裂解液分離成水相和有機(jī)相。RNA存

【RNA提取】RNA抽提的三大紀(jì)律八項(xiàng)注意！2021/08/30: 今天我們談一談RNA抽提的問(wèn)題。為了方便大家記憶，總結(jié)出了“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意”。紀(jì)律一：無(wú)外源酶的污染。外源酶會(huì)造成RNA的降解，造成RNA得率太低，或者*失敗。而外源酶又是無(wú)處不在的。這就要求注意以下三點(diǎn)：注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。手指和呼吸時(shí)重要的外源酶的來(lái)源。所以童鞋們做RNA抽提的時(shí)候，還是要全副武裝起來(lái)。這對(duì)自己也是一種保護(hù)措施。注意二：實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，槍頭，移液器，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要*處理。離心管和槍頭要用DEPC處理過(guò)，單純的消毒滅菌可不行呀。移液器和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要用75%的酒精擦過(guò)

基因研究做引物設(shè)計(jì)，一定要知道轉(zhuǎn)錄本能干什么！2021/08/30: 我們平常通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查找某個(gè)基因的相關(guān)信息時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)該基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。為什么一個(gè)基因可以有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本呢？轉(zhuǎn)錄本能干什么？轉(zhuǎn)錄本其實(shí)就是基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成的一種或多種可供編碼蛋白質(zhì)的成熟的mRNA。一個(gè)基因有可能有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，原因是由于不同的剪接方式造成的。我們都知道，基因轉(zhuǎn)錄之后，首先是形成前體mRNA，通過(guò)剪切內(nèi)含子連接外顯子，5’端加帽及3’端加尾之后形成成熟的mRNA。但是在剪切的過(guò)程中可能會(huì)剪切掉外顯子，也有可能保留部分內(nèi)含子，這樣就形成了多種mRNA即多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。舉個(gè)栗子：這是一個(gè)三個(gè)外

RNA反轉(zhuǎn)錄又失敗了？填坑還得看這六大要素！2021/08/30: 老話說(shuō)的好，萬(wàn)事開(kāi)頭難。而這話在RT-PCR中則較為體現(xiàn)出來(lái)，其開(kāi)頭的第一步——將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，表面上看似簡(jiǎn)單，實(shí)際上則暗潮洶涌，指不定就在哪里挖個(gè)坑，就會(huì)讓斗志高昂的實(shí)驗(yàn)汪們摔的鼻青臉腫，而且還不知道是咋掉坑的。顯然，RNA的反轉(zhuǎn)錄成功，不是想有就能有。大家之所以屢敗屢戰(zhàn)、屢戰(zhàn)屢敗，就是因?yàn)楹雎粤艘韵逻@6個(gè)要素，不然此坑早就被填平，又何至于整日里看著悲催的實(shí)驗(yàn)結(jié)果唉聲嘆氣呢？1.RTPrimer的*通常RTprimer可分為三類：oligodT，隨機(jī)引物以及基因特異性引物。Oligod

RNA轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)方法選擇和步驟2021/08/27: 正規(guī)化管理的實(shí)驗(yàn)室都會(huì)給新人進(jìn)行相關(guān)技能體系的培訓(xùn)，但是被老板散養(yǎng)的研究僧或者無(wú)奈從0開(kāi)始做科研的臨床醫(yī)生也不在少數(shù)。他們?cè)诔跏冀佑|分子實(shí)驗(yàn)時(shí)，手持《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》這本寶典，很容易被五花繚亂的實(shí)驗(yàn)方法亂了陣腳······連轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄都不太搞得清楚的科研新人如何根據(jù)自己的實(shí)際情況各取所需呢？首先，明確自己的定位，你目前要解決的是單個(gè)問(wèn)題而不是一口吃成一個(gè)大胖子，然后關(guān)鍵是明確實(shí)驗(yàn)對(duì)象和實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ｅe個(gè)栗子，現(xiàn)在手頭上的樣本是某個(gè)類型腫瘤臨床患者切除的組織，目的是檢測(cè)這些樣本與正常組織樣本

新型RNAi載體——saiRNA，更為安全的高效RNA干擾載體！2021/08/27: RNAi技術(shù)的前世今生造物真的很神奇。生物體有很多機(jī)會(huì)被來(lái)自病毒、細(xì)菌等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)。但宿主會(huì)說(shuō)，“你有張良計(jì)我有過(guò)墻梯”，這個(gè)過(guò)墻梯就是RNAi：宿主細(xì)胞會(huì)對(duì)這些外源性基因dsRNA隨即產(chǎn)生反應(yīng)，被核酸內(nèi)切酶Dicer切割成小片段RNA（即siRNA）。siRNA再與體內(nèi)一些酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA進(jìn)行特異性結(jié)合并將其切割，使得mRNA降解。然后siRNA還會(huì)

【RNAi與siRNA技術(shù)】基因敲除鼠的實(shí)驗(yàn)建議2021/08/27: 如果是在做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而且是基因敲除鼠的實(shí)驗(yàn)，那么就會(huì)做大批量的小鼠基因型鑒定試驗(yàn)，來(lái)確定自己小鼠的基因型，然而，再做實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中往往會(huì)出現(xiàn)一些意想不到的結(jié)果，在這里為大家提一點(diǎn)點(diǎn)小建議。提取DNA1、組織提取DNA剪下老鼠0.5-1.2cm尾巴或者耳朵或者稱取20mg組織樣本，將樣本剪碎放在1.5ml的EP管中。2、在每個(gè)EP管中加入275微升的裂解液（我們實(shí)驗(yàn)室使用的是promega的試劑盒）將加入裂解液的組織放在55攝氏度的水浴箱中過(guò)夜（16—18h）裂解*的標(biāo)志是組織*溶解。3、第二天振蕩

一篇就夠了，帶你了解高通量測(cè)序！2021/08/27: 說(shuō)到近十年來(lái)發(fā)展最迅猛的生物技術(shù)，首先想到了高通量測(cè)序,我們研究基因組學(xué)都離不開(kāi)它。目前，高通量測(cè)序已經(jīng)深入到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，不僅有力地推動(dòng)了基礎(chǔ)研究的發(fā)展，也在逐漸征服臨床應(yīng)用。所謂的高通量測(cè)序技術(shù)，又名大規(guī)模平行測(cè)序，是將DNA（或者cDNA）隨機(jī)片段化、加接頭，制備測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)對(duì)文庫(kù)中數(shù)以萬(wàn)計(jì)的克隆(colony)進(jìn)行延伸反應(yīng)，檢測(cè)對(duì)應(yīng)的信號(hào)，最終獲取序列信息。與Sanger法為代表的傳統(tǒng)測(cè)序法相比，高通量測(cè)序技術(shù)在處理大規(guī)模樣品時(shí)具有顯著的優(yōu)勢(shì)，又快（兩天）又多（數(shù)百萬(wàn)克隆），成為

避免踩坑，注意別踩DNA測(cè)序里的大坑！2021/08/27: DNA測(cè)序技術(shù)自從發(fā)明以來(lái)，作為一種重要的分子生物學(xué)手段，正在科研和臨床上得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。下面，介紹一下DNA測(cè)序里的大坑。給大家一個(gè)前車(chē)之鑒吧?？右唬盒盘?hào)衰減/中斷測(cè)序信號(hào)衰減和中斷，是測(cè)序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題，原因多種多樣：模板中含有重復(fù)序列，模板中含有高級(jí)結(jié)構(gòu)，模板中GC含量過(guò)高等，都會(huì)使得測(cè)序信號(hào)衰減和中斷。另外，引物的質(zhì)量不好，試劑失活了，都會(huì)造成這種問(wèn)題。解決的方法：反其道而行之，采用反向引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序，然后通過(guò)序列拼接獲得全長(zhǎng)。有時(shí)候就象做拼圖游戲。大家havefun吧。這里，

DNA 甲基化測(cè)序常用方法2021/08/26: 隨著高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）技術(shù)的發(fā)展，使我們能夠從全基因組水平來(lái)分析5’甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，由此能夠發(fā)現(xiàn)很多傳統(tǒng)的基因組學(xué)研究所不能發(fā)現(xiàn)的東西，這就是所謂的“DNA甲基化測(cè)序”！DNA甲基化測(cè)序方法按原理可以分成三大類：1、重亞硫酸鹽測(cè)序；2、基于限制性內(nèi)切酶的測(cè)序；3、靶向富集甲基化位點(diǎn)測(cè)序；基于以上原理又有數(shù)種不同的測(cè)序方法，下面，就介紹10種DNA甲基化測(cè)序的常用方法：1)重亞硫酸鹽測(cè)序該方法可以從單個(gè)堿基水平分析基因組中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重?zé)熈蛩猁}對(duì)基因組DNA進(jìn)行處

電泳中的異常現(xiàn)象及其原因分析2021/08/26: 跑電泳是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本技術(shù)。只要做分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)，可能或多或少，或早或晚都要跑跑電泳。有時(shí)候，跑電泳跑著跑著也會(huì)出現(xiàn)一些奇奇怪怪的現(xiàn)象。下面，談一談跑電泳的過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生的異?，F(xiàn)象，可能的原因，以及處理的方法。1.加樣孔有熒光下圖的紅框部分就是一個(gè)典型的加樣孔有熒光的例子。發(fā)生這種現(xiàn)象可能的原因如下：首先一定有DNA的滯留，其次多含蛋白質(zhì)殘留；如果是比較特殊的樣品，其雜質(zhì)也可能致熒光。蛋白質(zhì)幾乎不會(huì)被EB染色，能出現(xiàn)熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組DNA(50kb)，如果

【DNA 電泳】教你做果凍：瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)技巧分享2021/08/26: 果凍晶瑩剔透，口感QQ的，其實(shí)果凍的原料瓊脂糖，也是我們平時(shí)用來(lái)跑電泳的材料，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)常用以DNA切膠回收，DNA分離和用于佐證DNA是否重組、質(zhì)粒等是否切開(kāi)。今天我們就來(lái)聊聊瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的一些小技巧小細(xì)節(jié)。第一步：膠液的制備稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱，直到瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8%瓊脂糖凝膠液?？傄后w量不宜超過(guò)錐瓶的50%容量。否則會(huì)溢出來(lái)的。還要擦洗微波爐。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的

【教程】構(gòu)建載體其實(shí)一點(diǎn)也不難！2021/08/26: 我們?cè)谘芯炕虻墓δ軙r(shí)，逃脫不掉的就是為了我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可能需要?gòu)建各種載體，比如表達(dá)載體，克隆載體，基因打靶載體等等。很多人在構(gòu)建載體的時(shí)候都感覺(jué)很困難，特別是對(duì)于一個(gè)剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的新人來(lái)說(shuō)那更是難上加難，*摸不著頭腦。那是因?yàn)槠鋵?shí)構(gòu)建載體是一個(gè)不小的工作量，需要經(jīng)歷很多的過(guò)程，比如首先我們需要設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn)，接下來(lái)還需要經(jīng)歷酶切酶連等過(guò)程，只要其中的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，那最終都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn)，一旦引物設(shè)計(jì)好，那接下來(lái)就非常簡(jiǎn)單了，今天重點(diǎn)就

表達(dá)融合蛋白時(shí)，如何把兩個(gè)基因拼接起來(lái)？2021/08/26: A君：我要表達(dá)一個(gè)ras加GFP融合蛋白，怎么設(shè)計(jì)引物？安培君：你的GFP標(biāo)簽蛋白在載體里還是要你自己插進(jìn)去？A君：是我自己插進(jìn)去。安培君：你打算怎樣融合？A君：是不是這樣？酶切A基因，酶切質(zhì)粒，把A先插入載體，篩選出克隆，然后酶切B基因，用不同的酶酶切質(zhì)粒，將B基因插入含A的載體。安培君：No,何必這么復(fù)雜，SOEPCR吧！A君：什么是SOEPCR？SOEPCR是一種通過(guò)寡聚合甘酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的DNA基因片段的方法。SOEPCR可簡(jiǎn)單地憑借互補(bǔ)引

教你如何做分子構(gòu)建，從此邁向科研達(dá)人！2021/08/25: 做過(guò)分子實(shí)驗(yàn)的人都知道，要想做的有效率有質(zhì)量是很苦逼的，1個(gè)月做100個(gè)克隆那都是小case，沒(méi)點(diǎn)看家的本事怎么行。如果再遇到比較稀有的基因，周旋個(gè)把月，那也是家常便飯。下面就和大家分享一些載體構(gòu)建的經(jīng)驗(yàn)，從此邁向科研達(dá)人！1.準(zhǔn)備工作俗話說(shuō)：用欲善其事，必先利其器。建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具，效果事半功倍哦。推薦兩個(gè)工具，一個(gè)是oligo軟件，常用于引物設(shè)計(jì)和酶切位點(diǎn)分析；另一個(gè)是DNAstar軟件，工具*大，一款全面的生物醫(yī)學(xué)軟件，用作DNA和蛋白質(zhì)序列分析、重疊群拼接和基因工程管理。2

學(xué)學(xué)序列拼接，想節(jié)省費(fèi)用的千萬(wàn)別錯(cuò)過(guò)！2021/08/25: 相信大家PCR之后一般要進(jìn)行測(cè)序以保證擴(kuò)增序列的正確性吧？由于測(cè)序能力的限制，目前好的公司也只能保證一個(gè)反應(yīng)800bp測(cè)準(zhǔn)。如果大家的克隆片斷大于1k，那么勢(shì)必要同時(shí)測(cè)兩個(gè)反應(yīng)，然后將兩個(gè)反應(yīng)得到的序列利用其相互重疊的部分進(jìn)行拼接，這樣才能得到完整的PCR產(chǎn)物序列。怎樣拼接呢？多付點(diǎn)錢(qián)，讓公司幫你拼接？實(shí)在沒(méi)有這個(gè)余錢(qián)了~好吧，還是自己老老實(shí)實(shí)學(xué)拼接吧！悲催的童鞋們走過(guò)路過(guò)不要錯(cuò)過(guò)......首先下載并安裝ContigExpress，打開(kāi)軟件：

你真的了解 TA 克隆嗎？2021/08/25: 首先，TA克隆是用于PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)中。那么在你做TA克隆時(shí)，需要準(zhǔn)備的前期工作是什么呢？1、設(shè)計(jì)引物P出你的目的基因不管你是手動(dòng)設(shè)計(jì)還是軟件設(shè)計(jì)或是直接引用別人已經(jīng)發(fā)表文章用到的引物，只要能P出來(lái)目的片段就行，在PCR的結(jié)果中需要注重P出來(lái)的濃度，要達(dá)到濃度高的要求一方面是在前期的樣本準(zhǔn)備本身就得到高濃

上圖！教你秒懂重組 DNA 技術(shù)常用工具酶！2021/08/25: 1分子剪刀——限制性內(nèi)切酶：作用：識(shí)別特異序列，切割DNA限制酶的命名是根據(jù)細(xì)菌種類而定，以EcoRI為例：2膠水——DNA連接酶作用：跟限制性內(nèi)切酶對(duì)著干，催化DNA中相鄰核苷酸間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口縫合，連接DNA片段。無(wú)論是雙股或是單股DNA的黏合，DNA黏合酶都可以借由形成磷酸雙脂鍵將DNA在3'端的尾端與5'端的前端連在一起。3DNA聚合酶就像玩拼圖能手，DNA聚合酶用于DNA復(fù)制，連接兩條DNA單鏈形成一條DNA雙鏈，作用于堿基對(duì)間的氫鍵。DNA聚合酶主要應(yīng)用于：a.合成雙鏈

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