StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium

StemGrowth series多能干細胞培養(yǎng)基

1、 產(chǎn)品描述

StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium為新一代無飼養(yǎng)層、化學(xué)成分明確的多能干細胞（PSC）專用培養(yǎng)基，基于國際標(biāo)準(zhǔn)mTeSR體系優(yōu)化開發(fā)，適用于人胚胎干細胞（hESC）及誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSC）的長期未分化增殖培養(yǎng)。本體系補充氨基酸結(jié)構(gòu)修飾的bFGF/FGF-G3、pro-TGF-β1和LR3IGF等高活性因子，通過精準(zhǔn)調(diào)控細胞內(nèi)外信號通路，維持PSC的自我更新與多能性正常表達。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 ?；锿扑]用細胞系

H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者來源DY043、iPSC-EGFP等

5、 新手須知

StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium 可和mTeSR及mTeSR plus、E8等體系快速轉(zhuǎn)化，對于先前培養(yǎng)于上述體系的細胞建議使用原體系復(fù)蘇至密度80%后進行傳代，傳代P2的天培養(yǎng)基已原培養(yǎng)體系Medium:StemGrowth 1:1并補充1x StemGrowth series 抗脅迫補充劑，第二天轉(zhuǎn)化為StemGrowth不含StemGrowth series 抗脅迫補充劑，繼續(xù)培養(yǎng)至P3即可適應(yīng)StenGrowth體系的日常培養(yǎng)、維護、擴增、凍存。

具體步驟如下:

a)     階段一：細胞復(fù)蘇與傳代準(zhǔn)備

復(fù)蘇與預(yù)培養(yǎng)：采用原培養(yǎng)體系（如mTeSR/mTeSR Plus/E8）復(fù)蘇細胞，待細胞密度達80%時進行傳代（P1）。

基質(zhì)包被：使用干細胞基質(zhì)膠預(yù)處理培養(yǎng)皿，優(yōu)化細胞貼附效率。

b)     階段二：培養(yǎng)基梯度轉(zhuǎn)換（P2代）

首日過渡：傳代后第1天，培養(yǎng)基按 原體系 : StemGrowth = 1:1 混合，并添加 1×StemGrowth series 抗脅迫補充劑（含多胺含抗壞血酸含Rho-i），維持細胞存活與克隆完整性。

次日轉(zhuǎn)化：第2天更換為 99% StemGrowth培養(yǎng)基（不含StemGrowth series 抗脅迫補充劑），持續(xù)培養(yǎng)至細胞密度達80-90%。

c)     階段三：適應(yīng)與擴增（P3代及后續(xù)）

采用純StemGrowth培養(yǎng)基進行常規(guī)傳代、擴增及凍存，每日換液（2 mL/孔，6孔板），建議傳代周期為3-4天。

注意事項：在使用時應(yīng)始終穿戴，在處理諸如人體細胞或其他生物及有害物質(zhì)時應(yīng)遵循安全的實驗室規(guī)程。

僅用于科學(xué)研究。

6、 使用說明

a)     基質(zhì)膠鋪板（以干細胞基質(zhì)膠-0827775包被6孔板為例）

a.1、分裝 基質(zhì)膠

1. 貨號0827775的基質(zhì)膠，操作說明中不標(biāo)注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為400 μL，則表明400μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /400=12。

2. 準(zhǔn)備12個無菌1.5 mL EP管，標(biāo)記基質(zhì)膠日期、操作人；1mL無菌吸頭；EP管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時。

3. 將基質(zhì)膠埋于碎冰中放置4℃冰箱過夜解凍，當(dāng)基質(zhì)膠解凍即可開始分裝。

注：在解凍時，將基質(zhì)膠放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的基質(zhì)膠、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。 混勻基質(zhì)膠，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中，并置于冰上。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 基質(zhì)膠 置于-20℃冰箱中保存。

a.2、鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12或者Rhoi Free鋪板液于50 mL離心管中，準(zhǔn)備4個6孔板與-20度預(yù)冷過夜，標(biāo)記基質(zhì)膠、批號、日期和操作人。

2. 1 mL無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時，取出一支冷凍的基質(zhì)膠（400μL）置于4℃冰箱解凍至化凍。

3. 準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的基質(zhì)膠、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過的基質(zhì)膠（5mL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的基質(zhì)膠加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于37°凝膠1小時后即可使用，或置于4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。

b)     復(fù)蘇hESC/iPSC（以6孔板為例）

1. 將水浴鍋預(yù)熱至37℃，并將基質(zhì)膠包被的6孔板，提前放置培養(yǎng)箱中約1小時恢復(fù)至室溫（15~30℃）。

2. 取4 mL StemGrowth多能干細胞培養(yǎng)基，按照1:1000比例加入4 μL的1xStemGrowth series 抗脅迫補充劑 ，恢復(fù)至室溫（15~30℃）。

注意：不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

3. 取出1支冷凍的細胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細胞懸液內(nèi)冰晶即將消失時取出。

4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160g離心5 min。

5. 吸棄上清，加入預(yù)溫的4 mL的StemGrowth多能干細胞培養(yǎng)基+1XStemGrowth series 抗脅迫補充劑制備細胞懸液，盡量避免吹打。

注：離心后可留200 μL上清液，輕彈管底，使細胞懸浮液更均勻，避免成較大細胞團。

6. 吸除6孔板中2孔的基質(zhì)膠包被液，將細胞懸液按照2 mL/孔接種到1個孔中。

7. 水平十字搖勻三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

8. 18-24小時后換新的StemGrowth多能干細胞培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

注：在hPSC培養(yǎng)過程中，如果細胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。

c)      傳代hESC/iPSC（以6孔板為例）

1. 傳代條件：① 細胞匯合度達85%左右，一般情況下每4-8天傳代；② 細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過10天。

2.傳代比例：可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻，建議按照1:12進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例；密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:12傳代就是1個孔瓶傳12個孔（以6孔板為例）。

3. 將 基質(zhì)膠 包被的6孔板，提前放置培養(yǎng)箱中約1小時（~37℃）。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的StemGrowth多能干細胞培養(yǎng)基，并按1：1000比例加入StemGrowth series 抗脅迫補充劑，恢復(fù)至室溫（~25℃）。

5. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入2 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃并吸取。

6. 加入2 mL/孔的StemGrowth series 水解酶溫和消化液覆蓋孔底。

7. 置于37℃培養(yǎng)箱中孵育5-7 min。

注：① 消化5 min后鏡下觀察細胞變化，當(dāng)大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間；② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。

8.消化結(jié)束后輕輕地將細胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除消化液。

9.及時加入1 -2mL/孔預(yù)溫的StemGrowth多能干細胞培養(yǎng)基+1X StemGrowth series 抗脅迫補充劑，輕柔吹打小于3下使下細胞脫落。有部分細胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象。

10. 吸取6孔板中的基質(zhì)膠溶液，加入預(yù)溫的StemGrowth多能干細胞培養(yǎng)基+1X StemGrowth series 抗脅迫補充劑 2 mL/孔。

11. 在6孔板上標(biāo)記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細胞的損傷，可以將步驟9獲得的細胞懸液收集至2mL離心管，輕柔顛倒混勻細胞1-2次；再按照傳代比例接種。

12. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。

13. 18-24小時后更換新StemGrowth多能干細胞培養(yǎng)基，此后每天換液，4-8天后繼續(xù)傳代/凍存。

表1：hESC/iPSC傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

d)     凍存hESC/iPSC（以6孔板為例）

1. 當(dāng)細胞匯合度達85%左右可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存2管。

2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標(biāo)記細胞名稱、代次（P#）、日期、操作人。

3. 取出4℃冰箱中的StemFreez 無蛋白干細胞凍存液 ，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃數(shù)次，再吸棄。

5. 加入2 mL/孔的StemGrowth series 水解酶溫和消化液，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中，計時5-7 min（可參考“C、傳代hESC/iPSC"步驟）。

6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取hESC/iPSC EDTA傳代液。

7. 搖勻預(yù)溫的StemFreez無蛋白干細胞凍存液，每孔加入1 mL凍存液，輕柔吹打3下，水平十字搖勻3次，隨后吸取細胞懸液500μL加入1.5/2 mL凍存管中。

8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

V2.1版

更新時間：2025/5/27