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StemGrowth series EBs 形成培養(yǎng)基

1、 產(chǎn)品描述

StemGrowth series EBs形成培養(yǎng)基是基于APEL2和TeSR的雙重優(yōu)化體系，其設計聚焦于多能干細胞（PSC）在懸浮培養(yǎng)中形成均一胚胎樣體（EBs）的生理需求。通過整合干細胞微環(huán)境調控與代謝適配原理，該體系在以下維度實現(xiàn)了高效EBs生成。本培養(yǎng)基將滲透壓精準調控至270-290 mOsm/kg范圍，模擬胚胎發(fā)育早期的細胞外液環(huán)境，減少因滲透壓波動引起的細胞膜張力異常。葡萄糖濃度優(yōu)化為4.5 g/L，平衡糖酵解（Warburg效應）與線粒體氧化代謝，通過長鏈IGF激活AMPK通路維持能量穩(wěn)態(tài)，同時抑制乳酸脫氫酶（LDH）活性，配合StemGrowth series 抗脅迫補充劑 1000x（ML-0827S10）可在48-72小時內(nèi)形成大小較為均一的EBs。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 ?；锿扑]用細胞系

H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者來源DY043、iPSC-EGFP等

5、 新手須知

注意事項：在使用時應始終穿戴，在處理諸如人體細胞或其他生物及有害物質時應遵循安全的實驗室規(guī)程。

僅用于科學研究。

6、 使用說明

a)      使用超低粘附96孔u底板48小時形成EBs

a.1、材料和試劑：

設備：DHS水平甩板機(041269)、生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱等

a.2、步驟

1、   基于多能干細胞培養(yǎng)SOP復蘇PSC，在六孔板中1:6傳代三次。

2、   第四代記P4，培養(yǎng)3-5天每天換液維持細胞狀態(tài)，使6孔板每孔細胞密度達到80%-90%。

3、   檢測PSC無出現(xiàn)邊緣分化情況、細胞核大、細胞克隆島密集。室溫預熱30mLEBs形成培養(yǎng)基+60μL 抗脅迫補充劑 1000x ，6mL 水解酶溫和消化液、6mL DPBS。

4、   使用預熱的DPBS洗滌孔板中的細胞一次，吸棄DPBS。每孔加入1mL的水解酶溫和消化液，37度孵育8-12分鐘后，不要吸棄消化液，每孔加入1mL的EBs形成培養(yǎng)基含抗脅迫補充劑吹打孔板中的細胞兩次，收集于15mL離心管，150g/5min 離心收集細胞。

5、   離心結束后吸棄上清，加入1mLEBs 形成培養(yǎng)基含抗脅迫補充劑重懸細胞，加入臺盼藍計數(shù)細胞、 檢測細胞活力。

6、   1mL 細胞懸液的細胞量一般大于2*10?個單細胞，活力大于80%再進行下一步使用，如若活力不夠， 請排查原因，如臺盼藍質量、孵育溫度等。

7、   將1mL的細胞懸液加入23mL的EBs 形成培養(yǎng)基含抗脅迫補充劑中，吹打10次，每孔100μL加入 超低粘附96孔u底板中，使用封口膜密封孔板，于水平甩板機 1500rpm/s 離心1min。

8、   取出孔板，裁開封口膜放入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第二天加入100μL EBs 形成培養(yǎng)基不含抗脅迫補充劑，一般24小時后單細胞即可聚團，48小時以上的EBs即可進行下游分化實驗。

b)     使用超低粘附6孔板和蜂窩板 72小時形成EBs

b.1、材料和試劑：

設備：DHS水平甩板機(041269)、生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱等

b.2、步驟

1、   基于多能干細胞培養(yǎng)SOP復蘇PSC，在六孔板中1:6傳代三次。

2、   第四代記P4，培養(yǎng)3-5天每天換液維持細胞狀態(tài)，使6孔板每孔細胞密度達到80%-90%。

3、   檢測PSC無出現(xiàn)邊緣分化情況、細胞核大、細胞克隆島密集。室溫預熱30mLEBs形成培養(yǎng)基+60μL 抗脅迫補充劑 1000x ，6mL 水解酶溫和消化液、6mL DPBS。

4、   使用預熱的DPBS洗滌孔板中的細胞一次，吸棄DPBS。每孔加入1mL的水解酶溫和消化液，37度孵育8-12分鐘后，不要吸棄消化液，每孔加入1mL的EBs形成培養(yǎng)基含抗脅迫補充劑吹打孔板中的細胞兩次，收集于15mL離心管，150g/5min 離心收集細胞。

5、   離心結束后吸棄上清，加入1mLEBs 形成培養(yǎng)基含抗脅迫補充劑重懸細胞，加入臺盼藍計數(shù)細胞、檢測細胞活力。

6、   1mL 細胞懸液的細胞量一般大于2*10?個單細胞，活力大于80%再進行下一步使用，如若活力不夠， 請排查原因，如臺盼藍質量、孵育溫度等。

7、   將1mL細胞懸浮液加入8mL的EBs 形成培養(yǎng)基含抗脅迫補充劑上下吹打10次重懸細胞，對于超低粘附6孔板直接形成EBs，每孔加入3mL細胞懸液，培養(yǎng)箱中靜置30min后，放入水平搖床110rpm/s 37度培養(yǎng)過夜。第二天每孔再補充2mL的EBs 形成培養(yǎng)基不含抗脅迫補充劑，第三天觀察EBs的直徑大于100μm即可進行下游分化，某些細胞株系自然形成的EBs直徑可能過小，可以吸棄4mL孔板中的培養(yǎng)基(注意不要影響EBs)，加入2mL的EBs 形成培養(yǎng)基不含抗脅迫補充劑培養(yǎng)至72小時后進行分化。

8、   對于蜂窩板形成EBs的方案，完成第6步前，準備一把無菌的鑷子、一塊24孔細胞培養(yǎng)板，將蜂窩板用無菌鑷子夾入培養(yǎng)板的孔中(安裝于中心孔)，紫外滅菌30min。對上述重懸的9mL懸液，每孔600μL 的加入安裝了蜂窩板的孔板中，封口膜密封后，水平甩板機1500rpm/s離心5分鐘（記得使用 24 孔板配平）。離心結束后裁掉封口膜，37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第二天加入600μL EBs形成培養(yǎng)基不含抗脅迫補充劑再培養(yǎng)24小時即可進行下游分化實驗。

圖1:不同細胞系基于96孔u底板48小時內(nèi)形成的EBs，上4x物鏡，下10x物鏡

圖2:測試了不同細胞系使用蜂窩板 48小時內(nèi)形成大小均一的EBs，均為4x物鏡

V2.1版

更新時間：2025/06/24