NeuroCortex series 皮質(zhì)腦類器官誘導(dǎo)試劑盒

1、 產(chǎn)品描述

NeuroCortex系列皮質(zhì)腦類器官誘導(dǎo)試劑盒是?；镒灾餮邪l(fā)的前腦腹側(cè)化信號通路調(diào)控技術(shù)，專為模擬人腦皮質(zhì)發(fā)育及功能研究設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)體系。該體系通過時序激活Wnt/β-catenin及梯度抑制BMP/Smad信號，驅(qū)動人源多能干細(xì)胞（PSC）定向分化為高純度能神經(jīng)元（VGLUT1/2陽性率>85%），并同步誘導(dǎo)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（Pax6+/BLBP+）形成仿生腦室區(qū)結(jié)構(gòu)?？稍?span>60天內(nèi)穩(wěn)定生成直徑1.5-2.0 mm的層狀皮質(zhì)類器官，其特征性表達(dá)深層皮質(zhì)標(biāo)志物TBR1（第Ⅴ-Ⅵ層）及表層SATB2+神經(jīng)元（第Ⅱ-Ⅳ層），并伴隨MBP+/MOG+少突膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的致密髓鞘化（LFB染色陽性率>70%）。該體系通過三維旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器或超低粘附孔板中（3D-RBC，氧梯度維持在8-12%）實(shí)現(xiàn)高通量培養(yǎng)（單批次≥96個類器官）。本模型適用于神經(jīng)退行性疾病（如阿爾茨海默癥tau蛋白病理建模）、精神分裂癥NMDA受體功能解析及自閉癥譜系障礙突觸可塑性研究，同時兼容單細(xì)胞測序和鈣成像動態(tài)追蹤技術(shù)。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 Mogengel推薦用細(xì)胞系

H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者來源DY043、iPSC-EGFP等

5、 新手須知

NeuroCortex series 腦類器官誘導(dǎo)試劑盒理論上可以形成至少100個腦類器官，但是建議次誘導(dǎo)以1個六孔板啟動分化形成至少60-100個均一大小神經(jīng)上皮球/理想形成率60%。

注意事項(xiàng)：在使用時應(yīng)始終穿戴，在處理諸如人體細(xì)胞或其他生物及有害物質(zhì)時應(yīng)遵循安全的實(shí)驗(yàn)室規(guī)程。

僅用于科學(xué)研究。

6、 使用說明

a)     實(shí)驗(yàn)用品

基質(zhì)膠、干細(xì)胞培養(yǎng)基、皮質(zhì)腦類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基、超低黏附u底板/6孔培養(yǎng)皿其他類器官培養(yǎng)所需試劑、耗材；）

b)      使用程序：

b.1、PSC細(xì)胞培養(yǎng)及神經(jīng)上皮干細(xì)胞NESC的二維誘導(dǎo)

1、根據(jù)不同PSC細(xì)胞系的特性從ESC/＜60P、iPSCs＜50P中復(fù)蘇一支細(xì)胞、經(jīng)過兩次高質(zhì)量傳代記作復(fù)蘇后P3（干細(xì)胞培養(yǎng)操作見StemGrowth series / StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium培養(yǎng)SOP）

2、PSC傳代后兩天進(jìn)行神經(jīng)上皮誘導(dǎo)，觀測細(xì)胞形態(tài)成小島狀克隆，細(xì)胞克隆密度低于30%、無單細(xì)胞脅迫生長樣及應(yīng)激態(tài)球狀克隆團(tuán)即可進(jìn)行誘導(dǎo)。使用棄去干細(xì)胞培養(yǎng)基使用DMEM/F12潤洗兩次細(xì)胞去除漂浮細(xì)胞后每孔加入2m神經(jīng)上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2天換液一次，直到細(xì)胞克隆密度達(dá)到80%, 10x顯微鏡下觀測克隆邊緣圓潤光滑、細(xì)胞核縮小且變多，誘導(dǎo)時間計(jì)3-4天。

注意！PSC克隆出現(xiàn)問題、自分化及漂浮的情況應(yīng)再啟動復(fù)蘇擴(kuò)增一株，不可直接用于分化

b.1.1、從EB球直接神經(jīng)上皮誘導(dǎo)（新手建議此方法進(jìn)行分化)

1、   根據(jù)不同PSC細(xì)胞系的特性從ESC/＜60P、iPSCs＜50P中復(fù)蘇一支細(xì)胞、經(jīng)過兩次高質(zhì)量傳代記作復(fù)蘇后P3（干細(xì)胞培養(yǎng)操作見StemGrowth series多能干細(xì)胞培養(yǎng)基提供的PSC培養(yǎng)SOP）。

2、   將PSC細(xì)胞培養(yǎng)至80% 的克隆密度、克隆邊界清晰圓潤、細(xì)胞核質(zhì)比正常即可進(jìn)行EB誘導(dǎo)，DPBS洗滌細(xì)胞兩遍后使每孔用500ul的StemGrowth series 水解酶溫和消化液或StemGrowth series 消化液 消化6-10分鐘，觀測克隆變圓皺縮變亮、搖晃可見少量細(xì)胞脫離基質(zhì)即可終止消化。

3、   吸棄消化液，如若使用水解酶消化導(dǎo)致細(xì)胞大量漂浮則不吸棄，使用等量的StemGrowth series多能干細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。而無酶體系的StemGrowth series 消化液則吸棄后直接每孔加入500ul  StemGrowth series EBs 形成培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后收集于15ml或50ml離心管中（根據(jù)消化液種類靈活選擇）。

4、   水解酶消化后的細(xì)胞120g離心5分鐘棄除上清后，加入按消化的孔數(shù)*500ul 的體積加入EBs形成培養(yǎng)基重懸并補(bǔ)充1000x到1x的StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑，而無酶體系的StemGrowth series 消化液 消化后的細(xì)胞直接加入原重懸體系的（消化孔數(shù)*500ul）的體積的EBs培養(yǎng)基后補(bǔ)充1x的StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑。

5、   將細(xì)胞懸浮液+ 1x StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑加入加樣槽中或10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，使用排槍每孔100ul加入超低粘附96孔u底培養(yǎng)皿中，封口膜包好后水平甩板機(jī)1500rpm離心5分鐘，37度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第二天每孔加入100ul EBs(不含StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑)形成培養(yǎng)基，EB形成總時間約48小時。

6、   第三天吸棄EBs形成培養(yǎng)基，每孔加入200ul神經(jīng)上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)三天，第二天吸棄100ul再補(bǔ)液100ul去除培養(yǎng)代謝廢物。

b.2、神經(jīng)球形成（直接從EB誘導(dǎo)神經(jīng)上皮的方法不參考此步驟)

1、   將6ml StemGrowth series 水解酶溫和消化液預(yù)熱至RT后，放入生物安全柜，每孔使用1ml的DPBS洗滌誘導(dǎo)的神經(jīng)上皮干細(xì)胞兩次，每孔加入800ul-1000ul的StemGrowth series 水解酶溫和消化液，放入培養(yǎng)箱消化5-8分鐘，每4分鐘觀測一次細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞克隆邊緣卷起、細(xì)胞間隙變亮且有少量細(xì)胞漂浮于消化液中即可終止消化。

2、   從側(cè)壁處吸棄消化液，每孔加入1ml的神經(jīng)球形成培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后定容于12ml的神經(jīng)球形成培養(yǎng)基+12 ul的StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑，如若細(xì)胞消化過度大部分飄起則使用每孔1ml的DMEM/F12終止消化后120g/3min離心收集細(xì)胞后定容于12 ml的神經(jīng)球形成培養(yǎng)基+12ul StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑，注意:定容前臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性高于80%即可進(jìn)行下一步操作。

3、   準(zhǔn)備2個超低黏附96孔u底板，使用排槍每孔100ul細(xì)胞懸液加入孔中，封口膜包好后96孔板水平離心機(jī) 1500rpm/5min離心。

4、   離心結(jié)束細(xì)胞應(yīng)聚集于孔的一側(cè)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后每孔再次加入100ul的神經(jīng)球形成培養(yǎng)基不含StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑，神經(jīng)球形成誘導(dǎo)時間計(jì)2天。

5、   對于直接形成EB后誘導(dǎo)神經(jīng)上皮的體系，完成3天的誘導(dǎo)后吸棄神經(jīng)上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基每孔加入250ul神經(jīng)球形成培養(yǎng)基誘導(dǎo)2天。

b.3、神經(jīng)蓮座擴(kuò)張(兩種方案一致）

6、   當(dāng)神經(jīng)球直徑達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)時（200-600um），使用寬口200ul移液槍頭吸出神經(jīng)球于超低吸附6孔板中，每個孔最多容納10個神經(jīng)球，所以最少準(zhǔn)備2個六塊板啟動神經(jīng)蓮座擴(kuò)張。

7、   神經(jīng)球進(jìn)入6孔板中后，輕柔的每孔加入2ml神經(jīng)蓮座擴(kuò)張培養(yǎng)基后，放入十字/旋轉(zhuǎn)搖床80rpm/s上培養(yǎng)18天，每1-2天換液一次/每孔換液2ml。

b.4、皮質(zhì)腦成熟

當(dāng)神經(jīng)球中心和外側(cè)出現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)說明神經(jīng)蓮座擴(kuò)張到適合階段，棄去神經(jīng)蓮座擴(kuò)張培養(yǎng)基每孔加入2ml的皮質(zhì)區(qū)腦成熟培養(yǎng)基放入十字/旋轉(zhuǎn)搖床80rpm/s上培養(yǎng)18-26天/每2-3天換液一次即可用于鑒定和下游實(shí)驗(yàn)。成熟的腦類器官結(jié)構(gòu)上IF染色可見TUJ1/SOX2標(biāo)記的細(xì)胞形成VZ和SVZ樣的結(jié)構(gòu)，且高表達(dá)谷氨能相關(guān)基因，使用腦成熟培養(yǎng)基長期于搖床培養(yǎng)可以培養(yǎng)至120天中心細(xì)胞不出現(xiàn)凋亡。

當(dāng)皮質(zhì)腦培養(yǎng)至直徑大于1mm以上時，需對其進(jìn)行切割減少內(nèi)部細(xì)胞凋亡的情況。使用鋒利無鈍口的2號片將一個1mm以上的皮質(zhì)腦類器官切割成2-4塊，DPBS洗滌一遍類器官后，使用寬口1000ul移液槍頭轉(zhuǎn)移至15ml離心管中自然沉降（約需要5-8min），吸棄DPBS上清后，加入神經(jīng)蓮座擴(kuò)張培養(yǎng)基+1x StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑轉(zhuǎn)移入超低粘附六孔板80rpm/s 培養(yǎng)4天，每天換液。4天后加入更換為皮質(zhì)區(qū)腦類器官成熟培養(yǎng)基120rpm/s 繼續(xù)維持培養(yǎng)，可延長培養(yǎng)時間和類器官活性至180天。

V2.1版

更新時間：2025/6/6